Culturas primárias neuronais do cérebro de Tarde Stage Drosophila pupas

Summary

Este vídeo demonstra a preparação de culturas primárias de neurônios do cérebro de final de estágio Drosophila pupas. Pontos de vista de culturas vivas mostram crescimento de neuritos e imagem dos níveis de cálcio usando Fura-2.

Abstract

Neste vídeo, demonstramos a preparação de culturas primárias de neurônios do cérebro de final de estágio Drosophila pupas. O procedimento começa com a remoção dos cérebros de animais em 70-78 horas após a formação pupário. Os cérebros isolados são mostrados após incubação em breve papaína seguido por várias lavagens em soro livre de meio de crescimento. O processo de dissociação mecânica de cada cérebro em uma queda de 5 ul de mídia em uma lamela é ilustrado. Os axônios e dendritos dos neurônios pós-mitóticas são cisalhado off perto da soma durante a dissociação, mas os neurônios começam a regenerar os processos dentro de algumas horas de placas. Imagens mostram culturas vivas em dois dias. Neurônios continuar a desenvolver processos durante a primeira semana de cultura. Populações neuronais específicas podem ser identificadas em cultura usando GAL4 linhas a dirigir expressão tecido específico de marcadores fluorescentes, como GFP ou RFP. Gravações de células inteiras têm demonstrado que os neurônios cultivados forma funcional, espontaneamente ativa sinapses colinérgicas e GABAérgica. Um segmento pequeno vídeo ilustra a dinâmica do cálcio nos neurônios cultivados usando Fura-2 como um corante indicador de cálcio para monitorar transientes de cálcio espontânea e nicotina respostas evocadas de cálcio em um prato de neurônios cultivados. Estas culturas cérebro pupal são um sistema modelo útil em que as ferramentas genéticas e farmacológicas podem ser usados ​​para identificar os fatores intrínsecos e extrínsecos que influenciam a formação ea função de sinapses central.

Protocol

Preparações antes do dia da cultura: Fazer a solução de dissecar estéril. Faça DMEM estéril e manter em alíquotas de 10 ml a 4 ° C por 2 semanas. Tornar estéril DDM2 suplementos e congelar em 50 ou 100 mL alíquotas de 1 mês. Faça ConA / laminina. Lamínulas casaco. Opcional: Faça CNBM estéril e armazenar congelado por até 4 meses. No dia da cultura I. Preparar solução enzimática (ES), e…

Discussion

Neurônios colhidos os cérebros de roedores embrionárias / pós-natal podem ser cultivadas em cultura de células primária onde se estendem neurites e formam conexões sinápticas funcionais. Métodos para a preparação dessas culturas estão bem estabelecidas e estudos em culturas de roedores neuronal têm desempenhado um papel fundamental na identificação de genes e fatores ambientais envolvidos na regulação da formação de sinapses e função (Banker e Goslin, 1991). Enquanto os neurônios do inseto a partir de uma variedade de …

Materials

Material Name	Typ	Company	Catalogue Number	Comment
Concanavalin A		Sigma	C-2010	To 2.5 ml DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration. Make aliquots of 90 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma	L-2020	Add 1ml DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/ml concentration. Make aliquots of 10 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Biological Glassware	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 ml DS, 83.5 ul of ConA (167 ug/ml) and 8.35 ul of Laminin (0.835 ug/ml). Mix. Make aliquots of 100 ul and store at -20 C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution B” and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379). Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution A” and store at 4°C.

Coating Coverslips: Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish. Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip. Place in 37 C incubator for 2 hours. Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet. During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides. Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish. Store at room temperature for up to a month.