نحن تصف طريقة لتحليل ميكروأري لتحديد مستويات aminoacylation النسبية للجميع من tRNAs<em> س. cerivisiae.</em
aminoacylation الحمض الريبي النووي النقال ، أو الشحن ، يمكن أن تتغير بسرعة المستويات داخل الخلية استجابة للبيئة [1]. التغيرات في مستويات الحمض الريبي النووي النقال الشحن على حد سواء في الخلايا حقيقية النواة بدائية وتؤدي الى تنظيم متعدية وهو آلية رئيسية للاستجابة الخلوية الإجهاد. الأمثلة المألوفة هي استجابة الصارمة في<em> E. القولونية</em> والاستجابة للضغط النفسي Gcn2 المسار في الخميرة ([2-6]). العمل في الآونة الأخيرة<em> E. القولونية</em> و<em> س. خميرة</emوقد أظهرت> أن أنماط الحمض الريبي النووي النقال شحن ديناميكية للغاية ويعتمد على نوع من التوتر التي تعيشها الخلايا [1 ، 6 ، 7]. ديناميكية للغاية ، والطبيعة المتغيرة للشحن الحمض الريبي النووي النقال يجعل من الضروري لتحديد التغيرات في مستويات الحمض الريبي النووي النقال شحن على مستوى الجينوم ، من أجل التوضيح التام لاستجابة الخلايا للتغيرات البيئية. في هذا الاستعراض نقدم طريقة لقياس المستويات النسبية في الوقت نفسه فرض في جميع tRNAs<em> س. خميرة</em>. في حين أن البروتوكول المعروضة هنا للخميرة ، وقد تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح نسبي لتحديد مستويات الشحن في مجموعة واسعة من الكائنات الحية بما في ذلك<em> E. القولونية</em> والثقافات الخلية البشرية [7 ، 8].
نقدم طريقة لتحديد المستويات النسبية في آن واحد لجميع tRNAs شحن على مستوى الجينوم. وقد تم تحسين بروتوكول المعروضة هنا للS. البيرة ، وأيضا تم استخدامه بنجاح لقياس ملامح شحن في الحمض الريبي النووي النقال E. القولونية والثقافات الخلية البشرية. ويمكن تعديله لاستيعاب أي كائن مع تسلسل الجينوم المعروفة (السماح لشرح جميع الجينات الحمض الريبي النووي النقال) طالما ويمكن الحصول على الحمض الريبي النووي النقال مجموع المشحونة.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل عمل الخميرة في المختبر عموم بواسطة منحة من اليابان Ajinomoto شركة ، والمعاهد الوطنية للصحة منح التدريب T32GM007183 – 33. نشكر الدكتور رونالد Wek في كلية الطب جامعة إنديانا لتعاون طويل الأجل في المشاريع الخميرة. كما نشكر الدكتور كيمبرلي Dittmar لتطوير الحمض الريبي النووي النقال شحن ميكروأري الأسلوب.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Microspin G-25 columns | GE Healthcare | 25-5325-01 | ||
E. coli tRNAPhe | Sigma-Aldrich | R3143 | ||
E. coli tRNATyr | Sigma-Aldrich | R0258 | ||
E. coli tRNALys | Sigma-Aldrich | R6018 | ||
E. coli aminoacyl-tRNA synthetases | Sigma-Aldrich | A3646 | ||
T4 DNA ligase | USB | 70042X | ||
PerfectHyb Plus | Sigma-Aldrich | H-7033 | ||
Hyb4 station | Digilab | |||
GenePix 4000B scanner | Axon instruments | |||
GenePix 6.0 | Axon instruments |