Üç tek dalga boyu kısa darbeli lazerler bir arada tutarlı bir anti-Stokes Raman saçılması (CARS) ve iki kat rezonans ARABALAR (DR-CARS) oluşturmak için kullanılır. Bu sinyaller arasındaki fark, aksi takdirde tutarlı Raman sinyalleri algılamak için zor zayıf Raman sikliklerin görüntüleme sağlayan gelişmiş hassasiyet sağlar.
Tutarlı Raman görüntüleme teknikleri nedeniyle yüksek molekül özgüllüğü 1 etiket optik görüntüleme sağlamak için söz, son on yılda faaliyet dramatik bir artış gördük . Ancak, bu tekniklerin duyarlılık, Mili molar moleküler konsantrasyonları 1,2 gerektiren, floresan daha zayıf büyüklükte çok sayıda siparişi. Burada, biz, güçlü ya da bol Raman sikliklerin elde edilen sinyal yükseltme Raman-aktif moleküllerin zayıf ya da düşük konsantrasyonlarda tespit etkinleştirebilirsiniz bir teknik açıklar. Biyolojik örnek kısa atımlı lazerler etkileşim numuneye ilişkin benzersiz kimyasal bilgi taşıyan her biri tutarlı bir Raman saçılma sinyalleri, çeşitli üretir. Tipik olarak, bu sinyaller, örneğin Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılması (CARS), sadece biri diğerleri atılır bir görüntü oluşturmak için kullanılır. Ancak, 3-renk CARS ve dört dalga karıştırma (FWM) dahil olmak üzere bu diğer sinyalleri, toplanan ve CARS sinyal karşılaştırıldığında, aksi halde zor bilgi algılamak için 3 çıkarılan olabilir. Örneğin, iki kat rezonans ARABALAR (DR-CARS) iki rezonans sinyalleri 4 arasında yapıcı bir girişim sonucu . Biz göstermek DR-CARS lipidler 2845 cm -1 CH gerilmesi titreşim ve bir döteryumlanmış molekül (örneğin döteryumlanmış şekerler, yağ asitleri, vb) 2120 cm -1 CD germe titreşim sinyalleri üretmek için gerekli olan üç lazerler ince ayarının nasıl Raman rezonanslar aynı anda iki prob kullanılabilir. Bu koşullar altında, her rezonans, de üretilen problama DR-CARS kombine bir sinyal CARS sinyalleri ek olarak. DR-CARS sinyal ve zayıf sinyal duyarlılığı artırmak için kullanılan bol bir molekülün titreşim yükseltme sinyali arasındaki fark tespit nasıl göstermektedir. Biz bu yaklaşımı biraz daha güçlü bir çözücü Raman sinyal kullanarak örneğin seyreltik çözünen zayıf Raman sinyal artırabilirsiniz böyle iki sinyalleri farklı moleküllerden oluşturulan uygulamalar bile uzattığını gösteriyor.
Raman spektroskopisi ve Raman tabanlı görüntüleme biyolojik bilimler alanında güçlü gelişmekte olan araçlardır. Şu anda, bu in vivo ve in vitro çalışma Lipidlerin işleme ve depolama hücre metabolizması ve metabolik bozukluklar için özellikle doğrudur. En biyo-makromoleküller hücreleri ve organizmalardan elde edilen Raman genellikle yağlar, proteinler, nükleik asitler, şekerler katkıları konvolüsyon böylece benzer, çoğunlukla karbon bazlı moleküler bağlar çok sayıda içeren, vb Lipidler nispeten kolaydır çünkü yoğun damlacıkları veya bilayers formu kendi eğilim ve alifatik CH bağlarının çok sayıda uzun zincirler içerdiğinden, bu karmaşık spektrumları izole etmek. Ancak, karmaşık hücresel ortamı içinde, özel proteinler, amino asitler, RNA veya DNA izole etmek için yeteneği çok sınırlıdır. Ilgi, bu moleküllerin aşağıda sadece mcM konsantrasyonlarda, bu özellikle doğrudur. Burada, yeni sunulan DR-CARS fark görüntüleme tekniği kullanan zayıf Raman rezonanslar prob yeteneği kimyasal mikro ve görüntüleme için bir potansiyel olarak güçlü bir yaklaşım sağlar. Kuşkusuz, bu protokolün en karmaşık kısmı lazer sistemi ile uyum ve senkronizasyon. Sıfırdan başlarken, bakliyat senkronizasyon, yani, bakliyat, bir darbe autocorrelator kolaylaştırılabilir alan farklı yollar rağmen zaman çakışan sağlamak. Bir kere mekansal ve zamansal örtüşmesi durumunda, elde CARS ve DR-CARS sinyalleri kolayca algılanabilir olmalıdır. Ancak, ilk hizalama zayıf sinyaller sonucu, sık sık ham budur. Bu sistem iyi hizalamak için en iyi uygulama, başlangıçta zayıf sinyaller oluşturmak ve daha sonra yavaşça her yol boyunca verdiği aynalar ve gecikme aşamaları kullanarak temporal örtüşme ayarlayarak sinyal gücünü artırmak için. , Oda ışığında için çok etkili bir baffle olarak temiz oda ışıkları ile işletim sistemi ile elde edilebilir spektrometre / monokromatör eylemleri kapalı ve perde veya lens tüp çeşitli diğer ışık kaynaklarının (örneğin bilgisayar monitörleri tarafından tanıtılan arka plan en aza indirmek için rağmen gösterge ışıkları, LED, vb.)
Bizim özellikle kurulum, tek foton sayma çığ foto-diyot (AKB) dedektörleri ve algılama 5 için zaman korelasyon tek foton sayma (TCSPC) donanım kullanır . Bu bize son derece zayıf sinyalleri algılamak için nispeten düşük gürültü ama birçok grup benzer ölçümleri yapmak avantajlı değişken kazanç ile foto çoğaltıcı tüpler (PMT) bulduk sağlar. PMT avantajı değişken kazanç sunuyoruz ve dedektör Hatların çok daha büyük bir algılama alanı vardır. Ayrıca, kurulum ışını tarama ulaşmak için objektif çevirmek için piezo aşamaları kullanır. Bunun avantajı, yüksek bir doğruluk derecesi ile Önceden taranmış bir görüntüyü içinde herhangi bir noktaya dönmek ve spontan Raman dahil ek ölçümler almak yeteneğine sahip olmasıdır. Diğer gruplar tarama ayna meclisleri, ya da böyle çok daha hızlı görüntüleme sunar ama tam bir görüntü içinde keyfi yerlere dönmek için yeteneği sınırlı Olympus FluoView sistemi, hatta tüm konfokal tarama birimleri kullanılarak başarılı olmuştur.
Raman rezonans da, bazı optimizasyon isteyebilir kritik bir adımdır maç lazerler Tuning. Raman doruklarına DR-CARS ve CARS elde edilen maksimum spektral tepe yoğunluğu bilinen olabilir, ancak mutlaka kendiliğinden Raman tepe maksimum karşılık gelmiyor. Bu göreceli CARS spontan Raman spektrumları bozan olmayan bir rezonans arka plan sinyal ve CARS, giden dört-dalga karıştırma tarafından üretilen sinyallerin içsel girişime nedeniyle. CARS sinyalinin tepe spektral konumu hesaplanır, ancak daha pratik bir yaklaşım Raman rezonans beklenen konuma çapında birçok küçük spektral adımda OPOS ayarlamak için olabilir. Bu sürecin net bir maksimum verim gerekir. Aslında, hem rezonanslar DR-FWM büyük hassasiyet için maksimum ayarlanmış olmalıdır.
DR-CARS yaklaşımın son bir potansiyel sorunu da ele alınacak, yani DR-CARS sinyal Raman aktif yükseltme molekülünün homojen bir dağılım bağlıdır. Çoğu biyolojik nesneler için, bu iyi, bol ve neredeyse her yerde hazır ve nazır geniş su OH rezonans olabilir. Su Ancak, lipid modları güçlendirmek için su rezonans kullanılarak elde edilen sinyallerin bir bozulma önde gelen lipid damlacıkları gibi bir hücre ile hidrofobik bölgeler, dışında. Bizim örneğimizde, kolayca algılanabilir ve bol miktarda biyolojik örnek bir sinyal oluşturmak için döteryumlanmış glikoz solüsyonu kullanılabilir. Benzer şekilde, su Dötöro veya biyolojik Buffe döteryumlanmışrs, d-Hepes olarak kullanılabilir. Bizim örneğimizde, C. içinde lipid damlacıkları elegans solucan, her zaman sistem odaklı lazer nokta içinde, döteryumlanmış glukoz çözeltisi ve lipidler hem de içeren kadar küçük. Ancak bu, genellikle doğru değildir. Belirli bir örnek adipositler, kendi sitoplazma içinde oldukça geniş lipid damlacıkları oluşturmak olacaktır. Bu demektir ki, DR-CARS tekniği ile yapılan herhangi bir deney sonuçları doğrulamak için, dikkatli bir hazırlık ve kontrol deneyleri gerektirir.
The authors have nothing to disclose.
Biz gelişmekte olan DR-CARS tekniği Iwan Schie ve Sebastian Wachsmann-Hogiu katkıları için teşekkür etmek istiyorum. Tyler Hafta, Lawrence Livermore Ulusal Laboratuvarı Lawrence Akademik Programı tarafından destek kabul eder. Thomas Huser Yardım Hibe programı ile Amerikan Kalp Derneği destek için minnettar olduğunu. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı fon tarafından kısmen desteklenmiştir. Biophotonics, bir NSF Bilim ve Teknoloji Merkezi, Merkezi, Kooperatif Anlaşması No FİZ 0120999 altında, University of California, Davis tarafından yönetilmektedir. Destek UCD Klinik Araştırma Kaynakları (NCRR) Ulusal Merkezi'nden hibe sayısı UL1 RR024146 altında Translasyonel Bilim Merkezi de kabul edilmektedir.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
60X water immersion objective | Olympus | UPLSAPO 60XW | ||
Inverted Microscope | Olympus | IX-71SIF-3 | ||
Pockels Cell | ConOptics | 350-160 | ||
Picotrain pump Laser | HighQ | IC-1064-10000 | ||
Optical Parametric Oscillator | APE | Levante IR | ||
1.5 Glass cover slips | Fisher Scientific | 12-545-102 25cm-1 | ||
Half-wave plates | Thor Labs | AHWP05M-980 | ||
Polarizing Beam Splitter Cubes | Thor Labs | PBS052 or PBS053 | ||
Spectrometer/Monochromator | PI Acton | Spectra Pro 2300i | ||
CCD Camera | PI Acton | PIXIS: 100B | ||
Avalanche Photo Diode | Perkin Elmer | SPCM-AGR-14-12691 | ||
XYZ Piezo Stage | Physik Instruments | P 733-2CL P 721.CDQ |
This is a combination of an XY stage and a Z objective holder | |
Dichroic Mirrors | Semrock | Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25 |
These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient. | |
Dichroic Mirror | Chroma | Z830rdc | To combine the different near-infrared laser beams | |
TCSPC board | PicoQuant | Timeharp 200 | ||
Symphotime Imaging Software | PicoQuant | |||
Matlab | Mathworks |