Gramicidina baseado em Ensaio de fluorescência; para determinar Moléculas Pequenas Potencial para Modificação de Propriedades bicamada lipídica
Summary
Nós introduzimos um ensaio de fluorescência baseada rápido que monitora a taxa de extinção de fluorescência como uma medida da atividade do canal gramicidin. Os canais gramicidin são usados como transdutores de força molecular para monitorar as mudanças nas propriedades bicamada lipídica como sentiu por proteínas bicamada de expansão.
Abstract
Muitas drogas e outras moléculas pequenas usadas para modular a função biológica são anfifílicos que adsorvem na interface bicamada / solução e, assim, alterar as propriedades de bicamada lipídica. Isto é importante porque as proteínas da membrana são energeticamente acoplado a sua bicamada acolhimento por interações hidrofóbicas. Alterações nas propriedades bicamada, assim, alterar a função da membrana de proteína, que fornece uma maneira indireta de anfifílicos para modular a função das proteínas e um possível mecanismo para "fora do alvo" efeitos de drogas. Nós já desenvolveram um ensaio para a detecção de alterações eletrofisiológicas nas propriedades bicamada lipídica utilizando canais gramicidin linear como sondas 3,12. Canais gramicidina são mini-proteínas formadas pela dimerização transbilayer de duas subunidades não-condutor. Eles são sensíveis a mudanças em seu ambiente de membrana, o que os torna sondas poderosa para acompanhamento da evolução das propriedades bicamada lipídica como sentiu por proteínas bicamada de expansão. Nós agora demonstrar um ensaio de fluorescência para a detecção de alterações nas propriedades bicamada utilizando os mesmos canais como sondas. O ensaio é baseado na medição do tempo de percurso de extinção de fluorescência de fluoróforo-carregado vesículas unilamelares grandes devido à entrada de um supressor através dos canais gramicidin. Usamos o par indicador / supressor de fluorescência 8-aminonaftaleno-1 ,3,6-trisulfonate (ANTS) / Tl + que tem sido utilizado com sucesso em outros ensaios extinção de fluorescência 5,13. Tl + permeia a bicamada lipídica lentamente 8, mas passa facilmente através da realização de canais gramicidin 1,14. O método é escalável e adequado tanto para estudos mecanísticos e high-throughput screening de moléculas pequenas para bicamada perturbando, e potencial "fora do alvo", os efeitos. Nós achamos que os resultados obtidos utilizando este método estão em boa concordância com resultados anteriores eletrofisiológicas 12.
Protocol
Discussion
Nós demonstramos um ensaio de fluorescência baseada rápido para determinar o potencial de modificar bicamada de drogas e outros anfifílicos de pequeno porte. Compostos que modificam propriedades bicamada são susceptíveis de alterar a função da membrana de proteína de uma maneira indireta inespecífica, possivelmente contribuindo para "fora do alvo" efeitos de drogas. O ensaio explora o poder dos canais de gramicidin como sondas para mudanças nas propriedades bicamada 12 que são sentidos p…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Michael J. Bruno, Radda Rusinova e Jon T. Sack para muitas discussões estimulantes. Apoio financeiro do NIH, R01GM021342 e complementar ARRA R01GM021342-35S1, ea Josiah Macy, Jr. da Fundação para a SAOS, o Tri-I programa CMB para HII, e L. A Iris e Leverett S. Woodworth Medical Fellowship Scientist e NIH MSTP conceder GM07739 para RK.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ANTS | Invitrogen | A-350 | ||
| gramicidin | Sigma Chemical Co | G-5002 | ||
| 1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850398C | ||
| Mini-Extruder kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | ||
| PD-10 Desalting column | Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare | 54805 |
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