Optic Nerve transsectie: Een model van de volwassen Neuron Apoptosis in het centrale zenuwstelsel
Summary
Optic Nerve doorsnijding is een veel gebruikt model van de volwassen CNS verwonding. Negentig procent van de retinale ganglioncellen (RGC), waarvan de axonen volledig doorsneden (axotomy) sterven binnen 14 dagen na axotomy. Dit model is lastig om experimentele manipulaties en zeer reproduceerbaar.
Abstract
Retinale ganglioncellen (RGC) zijn CNS neuronen die uitvoer visuele informatie van het netvlies naar de hersenen, via de oogzenuw. De oogzenuw kan worden benaderd binnen de baan van het oog en volledig doorsneden (axotomized), het snijden van de axonen van de gehele bevolking RGC. Oogzenuw doorsnijding is een reproduceerbaar model van apoptotische neuronale celdood in de volwassen CZS 1-4. Dit model is vooral aantrekkelijk omdat het glasvocht kamer van het oog werkt als een capsule voor drug delivery aan het netvlies, waardoor experimentele manipulaties via intra-oculaire injectie. De verspreiding van chemische stoffen door het glasvocht vloeistof zorgt ervoor dat ze reageren op de hele RGC bevolking. Bovendien kan RGC selectief worden getransfecteerd door het toepassen van korte interfererende RNA (siRNA's), plasmiden, of virale vectoren om het afgesneden uiteinde van de oogzenuw 5-7 of injecteren van vectoren in hun doel, de superieure colliculus 8. Dit stelt onderzoekers in staat om apoptotische mechanismen in de gewenste neuronale populatie bestuderen zonder verstorende effecten op andere omstander neuronen of de omliggende glia. Een bijkomend voordeel is het gemak en de nauwkeurigheid waarmee de overleving van de cel kan worden gekwantificeerd na letsel. Het netvlies is een vlak, gelaagd weefsel en RGC zijn gelokaliseerd in de binnenste laag, het ganglion cel laag. Het voortbestaan van RGC kan worden gevolgd na verloop van tijd door het toepassen van een fluorescerende tracer (3% Fluorogold) om het afgesneden uiteinde van de oogzenuw op het moment van axotomy, of door het injecteren van de tracer in de superieure colliculus (RGC doel) een week voorafgaand aan de axotomy. De tracer is retrogradely vervoerd, de etikettering de hele RGC bevolking. Omdat de ganglion cellaag is een monolaag (een cel dik), kan RGC dichtheden worden gekwantificeerd in flat gemonteerd weefsel, zonder de noodzaak voor stereology. Oogzenuw doorsnijding leidt tot de apoptotische dood van 90% van de gewonden RGC binnen 14 dagen postaxotomy 9-11. RGC apoptose heeft een karakteristieke tijd-cursus, waarbij celdood wordt vertraagd 3-4 dagen postaxotomy, waarna de cellen snel degenereren. Dit levert een tijdvenster voor experimentele manipulaties gericht tegen routes die betrokken zijn bij apoptose.
Protocol
Discussion
Er zijn vele variaties van deze chirurgische procedure en een aantal van de stappen in dit protocol zijn niet nodig. Het is alleen nodig om de spieren die de oogzenuw liggen boven om toegang te krijgen tot de zenuw trekken. Echter, dit resulteert in een zeer beperkte werkruimte rondom de zenuw waardoor de kritieke laatste stadia van doorsnijding moeilijker. In bepaalde situaties is het wenselijk om transfecteren de cellen van de oogzenuw stomp en de toegenomen toegang tot de ruimte geboden door het terugtrekken van alle…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PDK wordt ondersteund door een CIHR exploitatiesubsidie (MOP 86523)
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Stereotaxic Frame | Stoelting, Kopf, WPI | |||
| Rat Gas Mask | Stoelting, Kopf, WPI | |||
| Anesthesia System | VetEquip | 901806 | ||
| Isoflurane (PrAErrane) | Baxter Corp | DIN 02225875 | ||
| Surgical Microscope | WPI, Zeiss, Leica | |||
| Fluorogold -(Hydroxystilbamidine bis(methanesulfonate) | Sigma | 39286 | ||
| Gelfoam | Pharmacia & Upjohn | |||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | |||
| Proviodine | Medline | MDS093945H | ||
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Fine tip Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | ||
| Micro surgical hook | Fine Science Tools | 10062-12 | ||
| Eye dressing serrated forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | ||
| Dumont #7b sharp curved serrated forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | ||
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 |
Referenzen
- Bahr, M. Live or let die – retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).
- Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration. Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).
- Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).
- Weishaupt, J. H., Bahr, M. Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system – molecular death and survival pathways. Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).
- Valenzuela, G. a. r. c. i. a., E, S. C. S. h. a. r. m. a. Rescue of retinal ganglion cells from axotomy-induced apoptosis through TRK oncogene transfer. Neuroreport. 9, 3165-3170 (1998).
- Kugler, S. Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death. Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).
- Lingor, P. Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo. Brain. 128, 550-558 (2005).
- Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neurowissenschaften. 125, 903-920 (2004).
- Berkelaar, M. Axotomy results in delayed death and apoptosis of retinal ganglion cells in adult rats. J Neurosci. 14, 4368-4374 (1994).
- Villegas-Perez, M. P. Influences of peripheral nerve grafts on the survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells in adult rats. J Neurosci. 8, 265-280 (1988).
- Villegas-Perez, M. P. Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats. J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).
- Quigley, H. A. Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36, 774-786 (1995).
- Thanos, S. Specific transcellular carbocyanine-labelling of rat retinal microglia during injury-induced neuronal degeneration. Neurosci Lett. 127, 108-1012 (1991).
- Thanos, S. Specific transcellular staining of microglia in the adult rat after traumatic degeneration of carbocyanine-filled retinal ganglion cells. Exp Eye Res. 55, 101-117 (1992).
