Em Quantificação in vivo de proteínas G Interações Receptor Acoplado usando espectral Resolvido Microscopia de dois fótons
Summary
Empregando um espectralmente resolvido dois fótons sistema de imagens de microscopia, pixel-nível mapas de Förster Resonance Energy Transfer (FRET) eficiências são obtidas para células que expressam receptores de membrana para formar a hipótese de homo-oligoméricos complexos. Da FRET mapas eficiência, somos capazes de estimar informações sobre o complexo estequiométrico oligômero em estudo.
Abstract
O estudo de interações de proteínas em células vivas é uma importante área de pesquisa, pois as informações acumuladas tanto aplicações benefícios industriais, bem como aumenta o conhecimento fundamental biológico básico. Förster (fluorescência) Resonance Energy Transfer (FRET) entre uma molécula doadora em um estado eletronicamente animado e uma molécula de aceitador próxima tem sido freqüentemente utilizado para estudos de interações proteína-proteína em células vivas. As proteínas de interesse são marcados com dois tipos diferentes de sondas fluorescentes e expresso em células biológicas. As sondas fluorescentes são, então, animado, tipicamente utilizando a luz laser, e as propriedades espectrais da emissão de fluorescência que emana do sondas fluorescentes são recolhidas e analisadas. Informações sobre o grau de interações proteína é incorporada nos dados de emissão espectral. Tipicamente, a célula deve ser verificado um número de vezes para acumular informações suficientes espectral para quantificar com precisão a extensão das interações proteína para cada região de interesse dentro da célula. No entanto, a composição molecular dessas regiões pode mudar durante o curso do processo de aquisição, limitando a determinação espacial dos valores quantitativos da aparente FRET eficiências para uma média de células inteiras. Por meio de um microscópio resolvida espectralmente dois fótons, somos capazes de obter um conjunto completo de imagens espectralmente resolvido depois de apenas um scan de excitação completa da amostra de interesse. A partir destes dados pixel-nível espectral, um mapa da FRET eficiência em toda a célula é calculada. Através da aplicação de uma teoria simples de FRET em complexos oligoméricos à distribuição obtidos experimentalmente de FRET eficiência em toda a célula, uma única digitalização espectralmente resolvido revela informações estequiométrica e estrutural sobre o complexo de oligômero em estudo. Aqui nós descrevemos o processo de preparação de células biológicas (a levedura Saccharomyces cerevisiae) expressando receptores de membrana (estéril duas α-factor receptors) marcadas com dois tipos diferentes de sondas fluorescentes. Além disso, ilustrar os fatores críticos envolvidos na coleta de dados de fluorescência usando o espectro resolvido dois fótons sistema de imagens de microscopia. O uso deste protocolo pode ser prorrogado para estudar qualquer tipo de proteína que pode ser expresso em uma célula viva com um marcador fluorescente ligado a ele.
Protocol
Discussion
Nesta apresentação, que ilustrou como para determinar o tamanho e as informações estruturais sobre um complexo de oligômero proteína in vivo. Embora os dados apresentados foram obtidos a partir de um receptor de membrana específica (ie Ste2p), expresso em células de levedura, o método é abrangente na medida em que pode ser aplicado a qualquer tipo de proteína expressa em qualquer tipo de célula, a única condição é que as proteínas são marcadas com os marcadores adequados fluorescentes. Modific…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Iniciativa de Crescimento UW-Milwaukee Research, do Instituto Biomédico de Wisconsin e Tecnologias da Saúde e da Fundação Bradley.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | ||
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | ||
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | ||
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma Aldrich | Y2001 | ||
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | ||
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | ||
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | ||
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | ||
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | ||
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | ||
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon | |||
| Spectrally resolved two photon microscope |
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