Una preparazione isolati retina per registrare Risposta Luce da Geneticamente etichetta cellule gangliari della retina
Summary
Questo articolo fornisce una descrizione del modo di sezionare e registrare dalla preparazione della retina isolata nel topo. In particolare, viene descritto come registrare le risposte luce da una popolazione di cellule gangliari fluorescente e successivamente identificare e analizzare la sua morfologia.
Abstract
I primi passi nella visione di vertebrati hanno luogo quando la luce stimola i coni e bastoncelli della retina 1. Queste informazioni vengono quindi segregati in quello che sono conosciuti come i percorsi di ON e OFF. Il segnale di fotorecettori informazioni luce alle cellule bipolari (BCS), che depolarizza in risposta ad un aumento (On jacket) o diminuisce (Off jacket) di intensità luminosa. Questa separazione di informazioni luce viene mantenuta al livello delle cellule gangliari della retina (RGCs), che hanno dendriti stratificando sia nel sublamina Off dello strato interno plessiformi (IPL), dove ricevono input eccitatorio diretto da Off jacket, o stratificazione in il sublamina Uno degli IPL, dove ricevono input eccitatorio diretto da On jacket. Questa separazione di informazioni riguardanti aumenti o diminuzioni di illuminazione (On e Off percorsi) è conservato e segnalato al cervello in parallelo.
Il RGCs sono le cellule di uscita della retina, e sono quindi una cellula importante studiare per capire come le informazioni luce viene segnalata a nuclei visiva nel cervello. I progressi della genetica dei topi negli ultimi decenni hanno portato ad una serie di linee fluorescenti topo giornalista dove vengono etichettati specifiche popolazioni di RGC con una proteina fluorescente per permettere l'identificazione dei sottotipi RGC 2 3 4 e specifici mirati per la registrazione elettrofisiologiche. Qui, vi presentiamo un metodo per registrare le risposte luce da cellule gangliari fluorescente in un intatto, preparazione isolato della retina. Questa preparazione isolato retina permette di registrazioni dal RGCs dove il pergolato dendritiche è intatto e gli ingressi in tutto il pergolato intero dendritiche RGC sono conservati. Questo metodo è applicabile su una varietà di sottotipi di cellule gangliari ed è suscettibile di una vasta gamma di tecniche fisiologiche cella singola.
Protocol
Discussion
Questa tecnica è applicabile a qualsiasi registrazioni delle cellule gangliari della retina da una retina isolata. Anche se in linea di mouse usato soprattutto intrinsecamente fotosensibili, melanopsina che esprimono RGCs sono etichettati con EGFP 2, 5, questo protocollo è facilmente trasferibile anche ad altre linee fluorescente RGC o può essere generalizzata a registrare da RGCs selezionati casualmente pure. Questa tecnica è particolarmente prezioso perché il pergolato dendritiche di ogni RGC e dei suo…
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti del NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Ringraziamo Darwin Hang per la sua assistenza tecnica.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ames’ Medium | Sigma | A1420 | ||
| Collagenase | Whorthington Biochemical | LS005273 | ||
| Hyaluronidase | Whorthington Biochemical | LS002592 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | ||
| AlexaFluor 594 Hydrazyde | Invitrogen | A10442 | ||
| Neurobiotin | Vector Laboratories | SP1120 | ||
| Electrodes | Sutter Instruments | BF120-69-10 | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | ||
| Ophthalmologic Scissor | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Streptavidin 594 | Invitrogen | S32356 | ||
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-001 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
Referenzen
- Wassle, H. Parallel processing in the mammalian retina. Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).
- Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development. J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).
- Huberman, A. D. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62, 327-334 (2009).
- Siegert, S. Genetic address book for retinal cell types. Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 29, 476-482 (2009).
- Newman, E. A., Bartosch, R. An eyecup preparation for the rat and mouse. J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).
- Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. Neurowissenschaften. 160, 126-139 (2009).
- Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision. J Neurosci. 27, 692-699 (2007).
- Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination. J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).
- Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina. Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).
