In dit protocol presenteren we een methode om te meten<em> Caenorhabditis elegans</em> Levensduur in 96 goed microtiterplaten.
Levensduur is een biologisch proces gereguleerd door verschillende genetische paden. Een strategie om de biologie van het ouder worden te onderzoeken is het bestuderen van dieren die haven van mutaties in componenten van de leeftijd-regelgevende paden. Als deze mutaties verstoren de functie van de leeftijd-regelgevende weg en dus veranderen de levensduur van het gehele organisme, ze belangrijke mechanistische inzichten 1-3.
Een andere strategie om de regulering van levensduur te onderzoeken is om kleine moleculen te gebruiken om verstoren leeftijd regelgeving paden. Tot op heden zijn een aantal moleculen waarvan bekend is dat de levensduur te verlengen in verschillende modelorganismen en worden gebruikt als instrumenten om de biologie van veroudering 4-16 studie. Het aantal geïdentificeerde moleculen tot nu toe is klein in vergelijking met de genetische "toolset" die beschikbaar is voor de biologie van veroudering te bestuderen.
Caenorhabditis elegans is een van de belangrijkste modellen die gebruikt worden om te studeren veroudering omwille van zijn uitstekende genetica en korte levensduur van drie weken. Meer recent heeft C.elegans ontpopt als een modelorganisme voor fenotype based drug-schermen 5,7,16-20 vanwege zijn kleine formaat en de mogelijkheid om te groeien in microtiterplaten.
Hier presenteren wij een test om te C.elegans levensduur te meten in 96 goed microtiterplaten. De test werd ontwikkeld en met succes gebruikt om grote bibliotheken scherm voor moleculen die C.elegans levensduur 7 uit te breiden. De betrouwbaarheid van de test werd geëvalueerd in meerdere tests: ten eerste, door het meten van de levensduur van de wild-type dieren gekweekt bij verschillende temperaturen, ten tweede, door het meten van de levensduur van de mutanten met gewijzigde levensduur, ten derde, door het meten van veranderingen in de levensduur in reactie op verschillende concentraties van het antidepressivum Mirtazepine. Mirtazepine al eerder is aangetoond dat de levensduur te verlengen C.elegans 7. De resultaten van deze tests tonen aan dat de test in staat is om eerdere bevindingen te repliceren van andere testen en is kwantitatief. De microtiterplaat formaat maakt ook deze levensduur test compatibel met geautomatiseerde liquid handling systemen en staat de integratie in geautomatiseerde platforms.
De gepresenteerde protocol maakt het meten van C.elegans levensduur in 96 goed microtiterplaten. Zoals getoond in de representatieve resultaten sectie is repliceert betrouwbaar eerdere bevindingen en geeft kwantitatieve informatie. Met behulp van deze test hebben we met succes meer dan 89.000 gescreende moleculen voor hun effect op C.elegans levensduur.
Voor de toepassing van drug-screening, het meten van de levensduur in een 96 wells microtiterplaat formaat heeft verschillende voordelen ten opzichte van de klassieke vaste media assay. Het vermindert de arbeid die nodig is voor de media de voorbereiding, de hoeveelheid van incubatie ruimte, en de hoeveelheid van het geneesmiddel nodig is. De 96-well formaat en de microscopie setup mogelijk automatisering van de gehele test voor high throughput screening.
Tijdens de ontwikkeling van de test meerdere waarden voor elke variabele en combinaties daarvan werden getest op hun effecten op C.elegans levensduur. Deze tests onder verschillende OP50 concentratie variërend van 3 tot 10 mg / ml (3, 4, 6, 8, 10 mg / ml), verschillend aantal wormen per well variërend van 7 tot 45 (7, 10, 15, 22, 45 wormen / well), andere cultuur volumes variërend van 40 tot 150 ul per putje (40, 60, 80, 100, 120, 150 pi), en veranderingen in de buffer samenstelling. Als je ze in met een carbenicilline-resistente OP50, noch carbenicilline of amfotericine B in de aangegeven concentraties bleken C.elegans levensduur beïnvloeden. Voortdurend zachtjes schudden van de platen, zoals vaak aanbevolen in C.elegans vloeibare cultuur, bleek overbodig voor de kleine volumes die in deze test. Zachtjes schudden is echter vereist als microtiterplaten met grotere putten worden gebruikt. De waarden die in dit protocol zijn zorgvuldig geselecteerd op basis van statistische vergelijking van de verschillende geteste condities.
De meest verrassende kenmerk van deze test is waarschijnlijk het feit dat C.elegans kunnen worden bewaard in platen met 96 putjes die zijn afgedicht met tape. Side-by-side vergelijking is niet gebleken dat het verschil in levensduur van de dieren gekweekt in niet-gesloten platen, in platen afgedicht met een plastic sealer, of in platen afgedicht met jagers die uitwisseling van lucht mogelijk te maken. In alle drie de voorwaarden, de dieren ontwikkelde zich zeer homogeen van L1 aan zwangere volwassenen binnen 65 uur en toonde zeer vergelijkbaar zijn levensduur. Dieren gekweekt in parallel op NGM ontwikkeld iets sneller, maar dit verschil was onafhankelijk van de afwezigheid of aanwezigheid van een sealer.
De gepresenteerde protocol is gebaseerd op levende bacteriën, maar kan worden aangepast voor dode bacteriën. Echter, in een vloeistof-test een enkele overlevende bacteriën kunnen zich snel vermenigvuldigen en opnieuw bevolken van de cultuur. In onze handen, de enige betrouwbare manier om bacteriën te doden in de mate dat ze kunnen worden gebruikt voor vloeibare cultuur wordt door langdurige behandeling van de bacteriën met gammastraling.
Een belangrijk punt om te overwegen bij het plannen van een levensduur van experiment is de kracht van detectie. Afhankelijk van de grootte van het effect, moet het effect van het geneesmiddel van belang worden getest in meerdere putten. In een typische test 4 geneesmiddel behandeld en 4 controle putten, wat overeenkomt ruwweg op 40-50 dieren per stuk, moet voldoende zijn om een 30% toename van de levensverwachting in meer dan 95% van de experimenten op te sporen. Stijgt van 14% slechts aangetroffen in 60% van de gevallen en vereisen daarom meer repliceren putten.
De rijkdom van de levensduur van gegevens die zijn gegenereerd door deze test kan worden gebruikt om te experimenteren ontwikkelen of stam specifieke parametrische Gompertz modellen 1. Deze Gompertz modellen zijn nuttig om de kracht van de opsporing te bepalen en om het aantal valse positieven en negatieven voor grootschalige schermen te schatten. We controleren de voorspellingen van deze modellen in blinde experimenten en gebruikte ze om het aantal valse negatieven in grote schermen (niet gepubliceerde resultaten) te schatten.
Kortom, we verwachten dat de gepresenteerde analyse zal van groot nut om kleine moleculen die de levensduur van C.elegans uit te breiden en de onderliggende mechanismen studie te identificeren.
The authors have nothing to disclose.
Dit protocol werd oorspronkelijk ontwikkeld bij Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle door Xiaolan Ye en Michael Petrascheck in het Laboratorium voor Linda Buck. De gedetailleerde versie van bovenstaande is opgesteld om de gehele procedure ter beschikking van de bredere gemeenschap te maken. Wij danken Carol Taylor, Sarah LeBoeuf en Andy Tomacelli voor het kritisch lezen van het protocol. Dit is manuscript # 2866 van het Scripps Research Institute. De Petrascheck Lab is gefinancierd door het Novartis ADI-programma.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Amphotericin B | Calbiochem | cat# 171375 | Also called Fungizone | |
FUDR | Sigma-aldrich | cat# F0503 | FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water | |
Mianserin | Sigma-aldrich | M2525-250MG | Use as positive control at 50μM final concentration | |
Cyproheptadine | Sigma-aldrich | cat#C6022-MG | Alternative positive control at 10 μM final concentration | |
Sealing Tape | Nunc | cat# 236370 | Polyester, non-sterile | |
96 well plate | Falcon | cat# 351172 | Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene | |
Nunclon flask | Nunc | cat# 178883 | used for large volumes |