Hier beschreven worden protocollen die worden gebruikt om het dynamische proces van MG53-gemedieerde celmembraan te herstellen in zijn geheel dieren en op cellulair niveau te visualiseren. Deze methoden kunnen worden toegepast op de celbiologie van de plasma membraan opnieuw sluiten en regeneratieve geneeskunde te onderzoeken.
Reparatie van acute schade aan het celmembraan is een elementair proces van het normale cellulaire fysiologie, en een defecte membraan reparatie is verbonden met een groot aantal degeneratieve ziekten bij de mens. De recente ontdekking van MG53 als een belangrijke component van het membraan opnieuw sluiten machinerie zorgt voor een betere moleculaire begrip van de fundamentele biologie van weefselherstel, alsook voor mogelijke translationeel toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Hier hebben we detail de experimentele protocollen voor het verkennen van de in vivo functie van de MG53 in de reparatie van spierletsel gebruik loopband te oefenen protocollen over muismodellen, voor het testen van de ex vivo membraan reparatie capaciteit door het meten van kleurstof toegang tot geïsoleerde spiervezels, en toezicht op het dynamische proces van de MG53-gemedieerde blaasje mensenhandel en celmembraan reparatie in gekweekte cellen met behulp van live cell confocale microscopie.
Loopband lopen is een nuttige methodiek op het verstrekken van een oefening belasting van de behandelde dieren. Als een methode voor het meten van spier functie of uithoudingsvermogen is een notoir luidruchtige benadering die is moeilijk uit te voeren in een consistent reproduceerbare wijze 8. In het algemeen kan tijden tot uitputting worden gebruikt als een eindpunt te grote verschillen tussen de experimentele groepen, zoals die tussen een aantal knock-out muis lijnen en wild type muizen 9 op te lossen. Experimentele manipulaties die meer subtiel verschil, zoals sommige farmaceutische processen te produceren, kan niet oplossen van verschillen boven de ruis in verband met deze techniek. Om het maximaliseren van de reproduceerbaarheid en de gevoeligheid van deze technieken is het belangrijk om de voorwaarden voor de sessie tot sessie te houden op de voet. De tijd van de dag de dieren worden uitgeoefend, evenals de warm-up periode gebruikte voorwaarden, zijn belangrijke factoren en consistent te blijven van proef tot proef.
Strain effecten kunnen grote invloed hebben op de vormgeving van loopband protocollen zoals bepaalde stammen van muizen kan voor veel meer tijd lopen op de loopband dan de andere stammen en reageren verschillend op uithoudingsvermogen te oefenen 10. Als algemene richtlijn, zullen veel muizen in staat zijn tot 200-300 meter in totaal een uitputting studie uitgevoerd met een constante verhoging van de snelheid van de loopband (5 m / m initiële snelheid met 1 m / m toegevoegde waarde voor iedere minuut na de start). Voor een uithoudingsvermogen te oefenen de muizen kunnen worden uitgevoerd tussen 9 tot 12 m / m voor 30 minuten twee of drie keer per week. Echter, de individuele studies vereisen doorgaans een optimalisatie van het protocol bij de individuele experimentele behoeften te voldoen.
De UV-laser schade procedure is aangetoond dat het een effectieve methode voor het meten van het membraan reparatie capaciteit van de skeletspieren vezels 3,6,11 worden. Een essentieel onderdeel voor het succes van deze experimenten is het gebruik van alleen spiervezels dat een rechte, staafvormige uiterlijk display met een regelmatig patroon van strepen en een soepele sarcolemma dat niet voorkomt rimpels. Als er andere spiervezels zijn geselecteerd membraan schade kan al aanwezig zijn in deze vezels en interpretatie van de resultaten van deze experimenten kunnen worden gecompliceerd. Het is ook belangrijk dat de oriëntatie van de vezels en de definitie van het bestraalde regio als gedefinieerd in figuur 1. Dit zorgt voor een letsel van reproduceerbare grootte, waardoor vergelijking tussen de vezels. Als het gedefinieerde gebied van letsel ligt volledig binnen de vezel, wordt een inwendig letsel worden gecreëerd in plaats van het verstoren van de sarcolemma. Daarnaast is de berekende waarde voor de AF / F 0 is zeer gevoelig voor de regio van belang geselecteerd voor het meten van de gemiddelde fluorescentie. Een oppervlakte van ongeveer 200μm 2, grenzend aan en met inbegrip van het letsel site geschikt is. In tegenstelling tot de regio gedefinieerd voor letsel, moet dit gebied volledig liggen in de vezel. Als u ook de ruimte buiten de vezel, zal de resulterende leeg gebied te verhogen AF / F 0 in vezels met weinig kleurstof entry terwijl het verlagen van AF / F 0 in vezels met een ernstiger fenotype. Dit vermindert de gevoeligheid van de test, waardoor vergelijking tussen vezels moeilijker.
Voor de micropipet schade test, moet de hoek tussen de micropipet en de glazen bodem schaal ongeveer 45 graden om effectief schade aan de celmembraan. De cellen werden gekozen voor micropipet schade moet stevig worden bevestigd aan de bodem van de schaal en de afgeronde cellen mag niet gebruikt omdat de meeste waarschijnlijk zullen ze los na micropipet porren. Saponin permeabilzation experimenten zijn minder technisch veeleisend en relatief sneller uit te voeren ten opzichte van penetratie testen micropipet. Er zijn echter een aantal beperkingen aan saponine schade, inclusief dat slechts een cel kan worden gebruikt per gerecht, omdat saponine zal verspreiden en andere cellen schade in die schotel.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | |
70 % ethanol | ISC Bioexpress | |
Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments | |
2 mg/ml collagenase type I | Sigma | |
0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick or equivalent | |
Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 |
LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Zeiss | |
FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | |
Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 |
Micropipette puller | Sutter Instruments | model P-97 |
3 axis micromanipulator | Narishige | MHW-3 |
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | BioRad | MHW-3 |
Saponin | Sigma | 47036 |