Ein einfaches Verfahren der Vibratom Schneiden des Corti-Organ, durch Immunhistochemie und konfokale Mikroskopie folgt beschrieben. Dieses Verfahren ermöglicht eine verbesserte Erhaltung der feinen Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ, und somit ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Zelltypen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Vibratom Sectioning für Enhanced Erhaltung der Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Säugetier-Corti-Organ ist ein hoch geordneter zellulären Mosaik mechanosensorischen Haar und nichtsinnlichen Stützzellen
(Besprochen in 1,2). Visualisierung von diesem zellulären Mosaik oft verlangt, dass das Corti-Organ im Querschnitt ist. Insbesondere kann die nichtsinnlichen Säule und Deiters 'Zellen, deren Kerne sind basal in Bezug auf die Haarzellen befinden, nicht sichtbar gemacht werden, ohne Querschliffe Corti-Organ. Allerdings ist die zarte Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ, einschließlich der feinen zytoplasmatischen Prozesse der Säule und Deiters 'Zellen, schwer durch routinemäßige histologische Verfahren wie Paraffin und Kryo-Schnitte, die kompatibel mit Standard-immunhistochemische Färbetechniken sind zu bewahren.
Hier beschreibe ich eine einfache und robuste Verfahren, bestehend aus Vibratom Schnitte der Cochlea, immunhistochemische Färbung dieser Vibratom Abschnitte in whole mount, durch konfokale Mikroskopie verfolgt. Dieses Verfahren wurde in großem Umfang für die immunhistochemische Analyse von mehreren Organen, einschließlich der Maus Gliedmaßenknospe, Zebrafisch Darm, Leber, Bauchspeicheldrüse und Herz (siehe 3-6 für ausgewählte Beispiele) verwendet. Darüber hinaus wurde dieses Verfahren erfolgreiche sowohl für Imaging und quantitificaton der Säule Zellzahl in der Mutante und Kontrollorgane von Corti in beiden Embryonen und erwachsenen Mäusen 7. Diese Methode ist jedoch derzeit nicht weit verbreitet, um die Säugetier-Corti-Organ zu untersuchen. Das Potenzial für dieses Verfahren, um beide bieten verbesserte Erhaltung der feinen Zytoarchitektur der erwachsenen Corti-Organ und erlauben die Quantifizierung der verschiedenen Zelltypen beschrieben.
Protokoll
1. Isolation und Fixierung der inneren Ohren
- Für die Analyse von zellulären Strukturierung im Corti-Organ, euthanize entsprechend inszeniert Embryonen oder Erwachsenen.
- Sezieren die Ohrkapsel, mit dem häutigen Innenohr. In der Maus, kann dies leicht an Embryonen in embryonale (E) Tag 14,5 und älter, in denen E0.5 der Tag, an dem ein Vaginalpfropf wurde erkannt wird getan werden. Dissektion der Ohrkapsel wird zunächst durch Enthauptung und die Öffnung des Schädels an der Mittellinie erfolgen. Entfernen Gehirn an beiden Ohren (Abb. 1A) aussetzen. Inner Ohren können geschält werden, aus intakten mit einer Pinzette (zB Dumont Nr. 5, Abb.. 1B). Wenn I....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Das Verfahren der Vibratom Schnitte, durch Immunhistochemie und konfokale Bildgebung gefolgt ermöglicht die Visualisierung des Corti-Organ mit minimalen Gewebeschäden. Offensichtlich zeigen konfokale Bilder aus dem internen Regionen in der Vibratom Abschnitt entnommen ausgezeichnete Erhaltung der Zellmorphologie, die nur durch Fixierung Artefakte begrenzt ist. Konfokale Bilder der Nähe der beiden cut-Oberflächen eines Vibratom Abschnitt entnommen werden oft von den Bildern aus dem internen Regionen zu unterscheiden, obw.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch das Medical College of Wisconsin IACUC gesetzt durchgeführt.
Danksagungen
Der Autor möchte die Nutzung der Kinder-Forschungsinstitut Imaging Core für die konfokale Mikroskopie und Dr. Jian Zhang für den Vorschlag bestätigen die Abschnitte mit Agaroseperlen montieren. Diese Arbeit wurde vom NIH DC010387 finanziert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare (optional) |
| Leica VT1000S vibrierender Klinge Mikrotom | Leica | ||
| Zeiss LSM510 Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop | Zeiss | ||
| Studentische Dumont Nr. 5 Pinzetten | Feine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way Einbettform | Polysciences | 18986 oder 18646A | |
| Rinderserumalbumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Ziegenserum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 Ziege anti-Kaninchen IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000-Verdünnung |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| Vakuumfett | Fischer | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
Referenzen
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).
- Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
