야생 조류에서 조류 독감 바이러스의 신속한 진단 : 현장에서 휴대용 RRT - PCR 및 정지 - 건조 시약의 사용
Summary
이 연구는 휴대용 RRT – PCR 시스템을 사용 야생 조류에서 조류 독감의 진단을 설명합니다. 방법은 확산 시나리오의 전형이 아닌 실험실 환경에서 야생 조류를 화면에 냉동 건조 시약을 활용합니다. 분자 도구의 사용은 신속한 진단을 위해 정확하고 민감한 대안을 제공합니다.
Abstract
야생 조류는 철새 flyways 따라 감시를하라는, H5N1 subtype의 고도 병원성 조류 독감 (HPAI)의 확산에 연루되었습니다. 조류 독감 바이러스에 대한 야생 조류 (AIV)의 샘플링은 종종 원격 지역에서 실시하지만, 결과는 종종 있기 때문에 분자 테스트 갖춘 실험실에 샘플을 수송하기 위해 필요 지연됩니다. 실시간 역방향 transcriptase 효소의 연쇄 반응 (RRT – PCR)은 AIV의 진단을위한 가장 정확하고 민감한 방법 중 하나를 제공하는 분자 기법입니다. RRT – PCR에 필요한 이전에 엄격한 실험실 프로토콜 이제 필드에 적응하고 있습니다. 서부 유럽 표준시 시약의 수준에서 감도로, 감기에 사슬을 요구하지 않습니다 (동결 건조된) 동결 건조 시약의 개발은 현장에게 실질적인 목표에 원격 테스트를 가져왔습니다.
여기 우리는 동결 건조된 시약을 고용 RRT – PCR 장치 (Ruggedized 고급 병원체 식별 장치 또는 신속한, 아이다호 기술, 솔트 레이크 시티, UT) (인플루엔자 대상 1 Taqman를 사용하여 야생 조류의 AIV의 신속한 진단을위한 방법을 제시, ASAY을 – ASY – 0109, 아이다호 기술). 시약은 단일 튜브 적절한 농도에서 테스트에 필요한 모든 구성 요소를 포함 : primers, 프로브, 효소, 버퍼 내부 긍정적인 컨트롤, 부적 절한 보관 또는 서부 유럽 표준시 시약의 처리와 관련된 오류를 제거합니다. 휴대용 단위는 매트릭스 유전자 후 2-3 시간 후에 산출 결과를 대상으로 인플루엔자에 대한 화면을 수행합니다. 유전자 subtyping은 H5와 H7 프라이머와 함께도 가능합니다되는 대상에게 적혈구응집소 유전자를 설정합니다.
시스템은 철새 쇼어 버드 종의 자리에 시연 등 야생 조류에서 수집 cloacal와 oropharyngeal 샘플에 사용, 북부 캘리포니아에서 캡처한 서부 샌드피퍼 (Calidrus mauri). 적합합니다 동물 처리는 미국 지질 조사국 서양 생태 연구 센터와 연구소를 Banding 미국 지질 조사국 버드의 허가의 동물 케어 및 사용위원회의 승인 절차를 따랐다. 이 기술의 주요 장점은 원격 위치에 확산을 포함하는의 기회를 증가, 야생 조류의 진단을 신속하게하는 것입니다. 현장 진단은 또한 야생 인구에 감염된 개인을 식별하고 공부에 대한 유용합니다. 호스트 생물학 (감염 면역 및 생리 반응)과 공간적 생태 (감염된 조류의 철새 실적)에 대한 정보를 수집하는 기회는 야생 조류가 장거리 AIV에 대한 벡터 역할을 수있는 범위에 대한 통찰력을 제공할 것입니다.
Protocol
Discussion
여기에 제시 빠른 진단 방법은 AIV의 감시에 대한 야생 조류 샘플 시간 효과적이고 정확하게 테스트를 용이하게합니다. 휴대용 RRT – PCR의 훨씬 덜 엄격한 표본 스토리지 요구 사항은 액체 질소 화주 또는 드라이 아이스를 사용할 수없는 경우 감기 체인의 유지 보수가 허무 수 있습니다 원격 상황에 적합합니다. 또한, 우리는 실험실 기반의 분자 분석의 최소한의 지식과 현장 생물학 자에 의해 수행?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 기술 지원과 자금 조달 (S. Schwarzbach 호텔) 및 지원 (K. Spragens, T. 그레이엄)의 USGS 서부 생태 연구 센터 M. 비천한 사람과 아이다호 기술의 R. 크리 스프 감사하고 싶습니다. 국방부와 공군 연구소의학과 지원 국방 및 국토 안보부 (www.idhs.org) 연구소 – 본 연구는 혁신적인 기술을위한 센터의 후원하에 수행되었다. 동물 처리는 미국 지질 조사국 서양 생태 연구 센터와 연구소를 Banding 미국 지질 조사국 버드의 허가의 동물 케어 및 사용위원회의 승인 절차를 따랐다. 이 간행물의 무역, 제품 또는 회사 이름의 사용은 설명용으로만 사용되며, 미국 정부에 의해 승인을 의미하지는 않습니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| RNeasy mini spin column | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Collection tubes (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| RNase-free water | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| 14.3 M β-mercaptoethanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml capillary tubes | Roche Applied Science | 04929292001 | |
| Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Pentium-based laptop with Windows XP Professional | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Lightcycler Data Analysis software | Idaho Technologies | Included in RAPID kit |
Referenzen
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