ReAsH / Flash d'étiquetage et d'analyse d'images de protéines dans les cellules du capteur Tetracysteine
Summary
Les colorants biarsenical Flash et ReAsH se lient spécifiquement aux motifs tetracysteine en protéines et peut sélectivement l'étiquette protéines dans les cellules vivantes. Récemment, cette stratégie d'étiquetage a été utilisé pour développer des capteurs pour les conformations de protéines différentes ou des états oligomériques. Nous décrivons la méthode d'étiquetage et des méthodes pour analyser quantitativement contraignant.
Abstract
Les protéines fluorescentes et les colorants sont des outils essentiels pour l'étude du trafic des protéines, la localisation et la fonction des cellules. Alors que les protéines fluorescentes telles que la fluorescence protéine verte (GFP) ont été largement utilisés en tant que partenaires de fusion aux protéines de suivre les propriétés d'une protéine d'intérêt de 1, les développements récents avec de petites balises permettent de nouvelles fonctionnalités de protéines pour être examinés dans les cellules, comme le changement conformationnel et en protéines d'association 2, 3. Un système de petite étiquette comporte un motif tetracysteine (CCXXCC) génétiquement inséré dans une protéine cible, qui se lie aux colorants biarsenical, ReAsH (rouge fluorescent) et Flash (vert fluo), avec une spécificité élevée même dans des cellules vivantes 2. Le système TC / biarsenical colorant offre beaucoup moins de contraintes stériques de la protéine de l'hôte que les protéines fluorescentes qui a permis à plusieurs nouvelles approches pour mesurer les changements de conformation et d'interactions protéine-protéine 4-7. Nous avons récemment développé une nouvelle application de balises TC que les capteurs d'oligomérisation dans les cellules exprimant la huntingtine mutante, qui, lorsqu'il est muté agrégats dans les neurones dans la maladie de Huntington 7. La huntingtine a été marqué avec deux colorants fluorescents, un pour une protéine fluorescente pour suivre la localisation des protéines, et le second un tag TC qui ne lie que les colorants biarsenical dans les monomères. Par conséquent, les changements dans colocalisation entre la protéine et la réactivité de teinture biarsenical permis teneur en oligomères submicroscopiques à être spatialement cartographié l'intérieur des cellules. Ici, nous décrivons comment étiqueter TC-protéines étiquetées fusionné à une protéine fluorescente (Cherry, la GFP ou PCP) avec le flash ou ReAsH en direct les cellules de mammifères et de la façon de quantifier la fluorescence à deux couleurs (Cherry / Flash, CFP / Flash ou GFP / combinaisons ReAsH).
Protocol
Discussion
L'approche de la localisation de la protéine étiquette avec une protéine fluorescente et les propriétés conformationnelles avec un second colorant offre beaucoup de potentiel pour la cartographie où les différentes conformations de protéines s'accumulent dans les cellules et les événements qui changent la dynamique de la conformation des protéines. ReAsH / Flash a été d'abord utilisé comme un capteur de cellules pour le repliement des protéines cellulaires de mammifères de l'acide rétino…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par des subventions aux DMH et TDM (NHMRC subventions de projet). DMH est Fellow Grimwade, financé par la Fiducie Miegunyah.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
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