Isolamento de células do sistema imunológico funcional cardíaca

Summary

Este método para isolar células do sistema imunológico funcional do coração fornece uma alternativa aos métodos convencionais de digestão da colagenase, que causa a ativação de células imunes indesejadas, resultando em uma capacidade de resposta diminuiu dessas células. Nosso método de isolamento de rendimentos funcional cardíaca células do sistema imunológico, evitando os problemas associados com a digestão enzimática.

Abstract

Cardíacas células do sistema imunológico estão ganhando interesse para os papéis que desempenham no remodelamento patológico em muitas doenças cardíacas ^05/01 Estas células do sistema imunológico, que incluem os mastócitos, células T e macrófagos;. Armazenar e liberar uma variedade de mediadores biologicamente ativos, incluindo citocinas e proteases, como triptase. ^6-8 Esses mediadores têm se mostrado os jogadores-chave no metabolismo da matriz extracelular pela ativação de metaloproteinases de matriz ou causando acúmulo de colágeno por função modular os fibroblastos cardíacos. ^9-11 No entanto, as técnicas disponíveis para isolar células do sistema imunológico têm cardíaca sido problemática, porque eles usam a colagenase bacteriana para digerir o tecido do miocárdio. Esta técnica faz com que a ativação das células imunes e, portanto, uma perda de função. Por exemplo, cardíaco mastócitos tornam-se significativamente menos sensíveis aos compostos que causam degranulação. ^{12 Por} isso, desenvolvemos uma técnica que permite a tele isolamento de células do sistema imunológico funcional cardíaca que levaria a uma melhor compreensão do papel destas células na doença cardíaca. ^{13, 14}

Este método requer uma familiaridade com a localização anatômica do rato processo xifóide axila, e ligamento falciforme, e pericárdio do coração. Estes marcos são importantes para aumentar o sucesso do procedimento e garantir uma maior produção de células do sistema imunológico cardíaca. Estes isolados cardíaca células do sistema imunológico podem então ser utilizados para a caracterização do fenótipo, funcionalidade, maturidade e co-cultura experiências com outras células cardíacas para obter uma melhor compreensão de suas interações.

Protocol

1. Preparação de sal de Hanks Balance Solution (HBSS) Autoclave um copo de vidro L, 1000 mL proveta graduada, e mexa bar. Reconstituir a solução HBSS pó no copo de vidro autoclavados 1 L para a marca de 900 mL com água destilada duas vezes. Misturar a solução HBSS com 3,4 g de sal Hepes Na + e ajustar o pH para um valor entre 7,35-7,41 usando HCL concentrado ou NaOH. Uma vez que o pH desejado foi atingido e permanece estável, adicionar 5 g de soro albumina bovina para a …

Discussion

Este método de isolamento de células do sistema imunológico cardíaca permite a análise de sua função, o fenótipo, e maturidade, sem a ativação indesejados que normalmente ocorre durante a técnica de isolamento enzimático de digestão tradicional. O número médio total de células obtidas com esta técnica é de cerca de 400.000 por coração de rato, e coloração diferencial e análise de citometria de fluxo destas células indica população mista de linfócitos T (~ 70%), macrófagos (~ 12%) e mastócito…

Materials

Name of Reagent and Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt	Sigma	H4891	One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic	Gibco	15240-062
HEPES	Sigma	H3784
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3912
250 mL Nalogene Filter Bottle	Thermoscientific	157-0020
12 N HCL	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water

Table of Specific Equipment:

Name of Reagent and Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
3-O Suture Silk Braided	Ethicon Products	SA64H
Small Animal Ventilator	CWE Incorporated	SAR-830	Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle	BD Biosciences	305199	Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter	Baxter	2N111	Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe	Fisher Scientific	14-823-16B
15 mL Falcon Tubes	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-377	Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone	Thermoscientific	S300030.02
Hemocytometer	Hausser Scientific	HS-LB-1483