Isolatie van Functionele Cardiac immuuncellen

Summary

Deze methode voor het isoleren van functionele immuun cellen van het hart biedt een alternatief voor de conventionele methoden van collagenase spijsvertering, die ongewenste immuun-cel activatie veroorzaakt, wat resulteert in een verminderde respons van deze cellen. Onze methode van isolatie levert functionele hart immuuncellen door het vermijden van problemen die samenhangen met enzymatische spijsvertering.

Abstract

Cardiale immuuncellen worden steeds belangstelling voor de rollen die zij spelen in de pathologische remodeling in veel hartaandoeningen ^1-5 Deze immuuncellen, die mestcellen, T-cellen en macrofagen bevatten;. Bewaren en laat een verscheidenheid van biologisch actieve mediators zoals cytokines en proteases zoals tryptase. ^6-8 Deze bemiddelaars is aangetoond dat de belangrijkste spelers in de extracellulaire matrix metabolisme worden door het activeren van matrix metalloproteinases of het veroorzaken van collageen accumulatie door het moduleren van de cardiale fibroblasten 'functie. ^9-11 echter beschikbare technieken voor het isoleren van het hart immune cellen is problematisch omdat ze bacterieel collagenase om de myocardweefsel verteren. Deze techniek zorgt voor de activatie van het immuunsysteem cellen en dus een verlies van functie. Bijvoorbeeld, cardiale mestcellen worden aanzienlijk minder reageren op stoffen die degranulatie kunnen veroorzaken. Daarom ^12, hebben we een techniek ontwikkeld die het mogelijk maakt voor tHij isolatie van functionele hart immune cellen, die zou leiden tot een beter begrip van de rol van deze cellen in hart-en vaatziekten. ^{13, 14}

Deze methode vereist een vertrouwdheid met de anatomische locatie van zwaardvormig de rat het proces, oksel en gebogen ligament, en hartzakje van het hart. Deze monumenten zijn belangrijk voor het succes van de procedure te verhogen en een hogere opbrengst van de cardiale immune cellen te verzekeren. Deze geïsoleerde hart immune cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor de karakterisering van functionaliteit, fenotype, volwassenheid en co-cultuur experimenten met andere hartcellen tot een beter begrip van hun interacties te krijgen.

Protocol

1. Voorbereiding van de Balance Hanks 'Salt Solution (HBSS) Autoclaaf een L glazen beker, 1000 ml maatcilinder, en roer bar. Los het poeder HBSS oplossing in de geautoclaveerde een L glazen beker op de 900 ml maatstreep met dubbel gedestilleerd water. Meng HBSS oplossing met 3,4 g van Hepes Na + zout en breng de pH op een waarde tussen 7,35-7,41 met behulp van geconcentreerde HCl of NaOH. Zodra de gewenste pH is bereikt en blijft stabiel, voeg 5 g runder serum albumine aan de…

Discussion

Deze methode van isoleren van cardiale immuuncellen maakt de analyse van hun functie, fenotype, en volwassenheid zonder de ongewenste activering die normaal gesproken optreedt tijdens een traditionele enzymatische vertering isolatie techniek. De gemiddelde totale aantal cellen verkregen met deze techniek is ongeveer 400.000 per rat hart, en differentiële kleuring en flowcytometrie-analyse van deze cellen geeft aan gemengde populatie van T-lymfocyten (~ 70%), macrofagen (~ 12%) en mast cellen met het gebruik van deze te…

Materials

Name of Reagent and Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt	Sigma	H4891	One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic	Gibco	15240-062
HEPES	Sigma	H3784
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3912
250 mL Nalogene Filter Bottle	Thermoscientific	157-0020
12 N HCL	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water

Table of Specific Equipment:

Name of Reagent and Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
3-O Suture Silk Braided	Ethicon Products	SA64H
Small Animal Ventilator	CWE Incorporated	SAR-830	Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle	BD Biosciences	305199	Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter	Baxter	2N111	Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe	Fisher Scientific	14-823-16B
15 mL Falcon Tubes	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-377	Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone	Thermoscientific	S300030.02
Hemocytometer	Hausser Scientific	HS-LB-1483