长期培养的人类乳腺癌标本，并利用光学投影层析成像分析

Summary

我们已经开发出一种基于胶原蛋白<em>在体外</em>促进所有乳腺癌亚型样本的增殖和侵袭的实验。利用光学投影层析成像，立体显微镜技术，可视化和量化肿瘤扩展。此法可用于量化个别肿瘤样本中的药物反应。

Abstract

乳腺癌是在西方世界造成的死亡率。它是公认的乳腺癌扩散，首先在本地和远端后，是在患者预后的主要因素。乳腺癌的实验系统依靠从原发肿瘤或胸腔积液通常派生的细胞株。两大障碍阻碍了这项研究：（一）一些已知的子类型的乳腺癌患者（尤其是预后不良的管腔乙肿瘤）没有代表在当前行的集合;（二）肿瘤微环境的影响通常不考虑。

我们展示一个小学文化的所有子类型的乳房癌标本的技术。这是通过使用三维（3D）文化系统中，小块的肿瘤是我垫在软大鼠胶原嵌入式。在2-3周之内，肿瘤细胞扩散到胶原蛋白，形成类似人类tumours1观察的各种结构。可行的脂肪细胞，上皮细胞和成纤维细胞内原有的核心，在组织学上可见一斑。 squamoid形态的恶性上皮细胞进行了论证，侵犯到周围的胶原质。这些细胞内，核异型明显，核分裂和凋亡小体。

我们所采用的光学投影层析成像（OPT），三维成像技术，以量化肿瘤的扩散程度文化。我们使用的OPT，测量肿瘤的文化体积，参数常规测量过程中的新辅助治疗的乳腺癌患者，以评估药物治疗的反应。

在这里，我们提供一个机会，文化的人类乳腺肿瘤，无分型的偏见和量化那些体内的扩散。这种方法可用于在未来量化在原发肿瘤的药物敏感性。这可以提供一个比目前使用的细胞株的预测模型。

Protocol

1。从鼠尾中提取胶原蛋白将在70％的乙醇新鲜冷冻老鼠尾巴。 Deglove覆皮肤，用手术刀暴露筋。 远离尾和70％的乙醇消毒地带筋。 称量收集的肌腱和转移到乙酸（1G肌腱至250ml 0.5M醋酸）。混合48小时在4 ° C。 离心机在10000克肌腱/醋酸酸混合为30min，弃去沉淀。 添加一个同等体积的10％（W / V）氯化钠去上清液，并允许混合一夜之间站在4 ° C。 10,000收集的丰富的胶原蛋白，不溶于底层为进一步30分钟离心G. 重悬在0.25米乙酸胶原蛋白丰富的材料在4 ° C，并在4 ° C，连续3天对1:1000醋酸透析，不断变化的，每天两次的透析缓冲。 进一步胶原溶液消毒离心（20000克为2小时）和存储在4 ° C。 除了一个1mg/ml的股票浓度无菌1:1000醋酸稀释胶原。 2。 3D含量创作 3D检测一个细胞系的实验基础上，此前公布的2。 多个核心活检收获同意在浸润性乳腺癌的治疗手术切除时患者。 用眼，划分到1毫米3片段使用手术刀的核心。修剪和丢弃宏观独特的脂肪。 沉浸在MEGM完整的媒体碎片。组织可以存储在这种状态下，以1小时。 要创建的胶原蛋白凝胶，混合冰1mg/ml的鼠尾胶原，1:1000过滤醋酸，10倍的DMEM/F12和0.22M的NaOH的3:5:1:1的比例，以创建最后的胶原蛋白浓度为0.3毫克/毫升。 进入孵化器的24孔板和地方的个别井注入胶原蛋白的混合物1.2毫升在37℃放置10min C至启动胶凝。 10min后，从孵化器中取出24孔板。胶原蛋白凝胶上的肿瘤块，轻轻推到中心使用一个加入10μl枪头凝胶。 24孔板返回为1小时的孵化器。 对于ER +肿瘤，补充MEGM完整的媒体与β-雌二醇浓度3.2×10 -10米一旦凝胶检测凝胶为1小时，仔细地介绍每孔培养基1.2毫升。最后的β-雌二醇测定的浓度范围内，将equilibriate 1.6×10 -10米复述生理雌激素水平在乳房组织3中发现。 运行每口井的内缘周围的加入10μl枪头，释放每个凝胶圆周，从而使每个凝胶媒体内自由浮动。返回的24孔板的孵化器。 交易所补充媒体的两倍，直到实验终止每周。消除媒体和添加福尔马林固定液终止实验。 3。光学投影层析成像抗体染色，在制剂的含量测定我们已经通过先前公布的方法，为整个样本染色 4 。 福尔马林固定标本用PBS 30分钟洗净。脱水凝胶逐步在PBS中含0.05％吐温20（0.05％PBST）甲醇稀释：33％，66％和100％≥15分钟，在每一步。 孵育组织在新鲜配制的甲醇：二甲亚砜：30％H 2 O 2在2时01分03秒的比例，在室温为24小时（15％V / V H 2 O 2）淬火的自体荧光。 甲醇30分钟，洗净样品两次。冻结的样品为-80 °彗星5次，每次至少1小时，回到室温（RT），以确保在组织的部位较深，抗原呈现的访问。 组织补充水分0.05％PBST以甲醇作为稀释剂（33％，66％和100％为15分钟，在每一步）。 座在24小时封锁的解决方案（10％在0.05％PBST血清）的组织。 与第一抗体孵育组织确定上皮的内容，使用的1:500稀释浓度在阻断含有5％二甲基亚砜为48小时的解决方案1.5毫升的兔抗细胞角蛋白。 洗四次0.05％PBST 30分钟每个样品。 与荧光二抗（1:100羊抗兔Alexa555）1.5毫升阻塞的解决方案，其中包含48小时5％DMSO稀释，孵育组织。 样品洗净，再与0.05％PBST 4次各为30分钟。 4。光学投影层析成像光学投影层析成像是一个以前开发的显微技术，生产厚度高达15毫米的5荧光生物标本的高分辨率三维图像。 安装的Stained在1％低熔点琼脂糖凝胶为24小时和100％甲醇脱水。清除BABB溶液（1:2苯甲醇，苯甲酸苄酯）的标本为48小时和巴勒斯坦被占领土3001M扫描仪（Bioptonics）进行扫描。 这两个目标和自体荧光捕获使用Cy3标记过滤设置（励磁545nm/30纳米七十五分之六百一十纳米），发射和GFP1过滤器设置（励磁425nm/40纳米，发射LP475纳米）。 5。重建和三维定量由被占领土获得的角预测可重构使用NRecon软件（SkyScan）创建一个截面切片通过一系列的入侵检测。该软件可免费下载http://www.skyscan.be/products/downloads.htm 。 分析使用Volocity软件（珀金埃尔默）的重建数据。免费演示软件可供下载， 在 http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/ 。 为了量化上皮细胞角蛋白染色量，设置一个最小的体素强度阈值，以减少在目标通道的背景荧光干扰。我们定义区在9000这个门槛经验使用在测量中的应用可用参数的列表，我们量化与原有的核心（在autofluorescent通道划分）的上皮连续性量，这使我们能够量化不同上皮生长量肿瘤样本。 6。代表性的成果： 在检测的发展，共52乳腺癌活检一个广泛的病理标本已被使用。其中<10％（5 / 52）未能提供至少一个可行的入侵检测。检测失败，是因为无论是细菌性上部感染或不足肿瘤活检材料。因此检测中的应用不仅限于一个具体亚型乳腺癌。 固定后20天胶原文化的典型分析（图1），并随后为角蛋白染色。 Volocity软件能够识别上皮大部分与原有的核心和侵入细胞的分离群体持续和量化每卷分别。 图1。侵袭实验，固定和量化。检测支持从多个亚型乳腺癌样本：A）ER + B）的HER2 +和C）雌激素受体。

Discussion

胶原蛋白为基础的分析，研究肿瘤细胞株的行为是目前广泛^使用的6,7,8。然而，这些实验都没有充分反映在肿瘤及其周围环境的复杂性。在这项研究中，我们显示，人类乳腺癌的材料，可用于以类似的方式， 体外 。此外，OPT是一个有用的工具来刻画乳腺癌的3D扩展。我们发现，这项技术的主要限制是肿瘤材料的可用性（单核心活检是足够4-6实验）。另一个限制因素是结构的入侵只是发生在约40％的检测。为了克服这个问题，我们会定期添加任何7天左右所需的治疗，所有检测明显增长。

在未来，可以延长使用OPT的，也发现大量变更 ，体外，药物治疗造成的。这反过来又可以促进更多的个性化的癌症治疗，独立的动物模型。目前，我们正在探索ER +肿瘤他莫昔芬体外的反应。

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue No.
MEGM Complete	Lonza	CC-3150
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8900 10X1L
β-oestradiol	Sigma-Aldrich	E8875-250MG
Rabbit anti-cytokeratin	Dako	Z0622
Goat anti-rabbit Alexa555	Invitrogen	A21422

All other standard reagents were obtained from Sigma-Aldrich.