Seguimiento de los cambios de equilibrio en la estructura del ARN por "peroxidación" y "oxidativo" Huella de radicales hidroxilo
Summary
Este protocolo describe la forma de cuantificar el Mg (II)-dependiente de la formación de la estructura del ARN superior mediante dos métodos de huella radical hidroxilo.
Abstract
Las moléculas de ARN desempeñan un papel esencial en la biología. Además de transmitir la información genética, el ARN puede plegarse en estructuras terciarias única que cumple un papel biológico específico, como regulador, carpeta o un catalizador. Información acerca de la formación terciaria de contacto es esencial para entender la función de moléculas de ARN. Radicales hidroxilo (OH •) son las sondas único de la estructura de los ácidos nucleicos, debido a su alta reactividad y tamaño pequeño. 1 Cuando se utiliza como una sonda de huellas, los radicales hidroxilo mapa de la superficie accesible al soluto de la columna vertebral fosfodiéster del ADN y el ARN 1 2 con tan fina como la resolución de un solo nucleótido. La huella radical hidroxilo se puede utilizar para identificar los nucleótidos dentro de una superficie de contacto intermolecular, por ejemplo, en el ADN en proteínas y complejos de un ARN-proteína. Equilibrio 3 y 4 cinética transiciones se puede determinar mediante la realización de la huella de radicales hidroxilo en función de un solutien la variable o la hora, respectivamente. Una característica clave de la huella es que la exposición limitada a la sonda (por ejemplo, "un solo ataque cinética") se traduce en la toma de muestras uniformes de cada nucleótido del polímero. 5
En este artículo, video, utilizar el dominio P4-P6 de la ribozima de Tetrahymena para ilustrar la preparación de ARN de la muestra y la determinación de Mg (II) mediada por las isotermas de plegado. Se describe la utilización del conocido protocolo de hidroxilo huella radical que requiere de H 2 O 2 (a esto lo llamamos el "peroxidación" protocolo) y un valor, pero no se conoce ampliamente, alternativa que utiliza naturalmente, O 2 disuelto (llamamos a esto "el oxidativo "protocolo). Una visión general de la reducción de datos, la transformación y los procedimientos de análisis se presenta.
Protocol
Discussion
La huella radical hidroxilo es una herramienta valiosa para evaluar el área de superficie accesible disolvente de los ácidos nucleicos. Formación cualitativa y cuantitativa de la estructura terciaria 14 se puede seguir en función de parámetros como el tipo de iones y la concentración, pH, temperatura, proteínas de unión o plegamiento factores de co-. La atractiva combinación de un protocolo sencillo y de bajo costo y la accesibilidad resulta solvente y la información de plegado en un nivel de nucle?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud-SR1 GM085130 y National Science Foundation MCB0929394. Agradecemos a la Dra. Marion Schmidt por su hospitalidad y por permitirnos filmar en su laboratorio.
Materials
| Name | Company | Cat# |
|---|---|---|
| Sodium Cacodylate (Caution! Toxic) | Sigma | C4945-25g |
| EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G |
| DEPC treated water | Ambion | AM9915G |
| Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 |
| MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G |
| Urea | Ambion | AM9902 |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 |
| tRNA | Sigma | R-7876 |
| Sodium-L-ascorbate | Sigma | A7631-25g |
| Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma | F1543-500g |
| RNase T1 | Fermentas | EN0541 |
| Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma | 349887 |
Referenzen
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