Bıçak kenar Tarama Mikroskopi için Numune Hazırlama, Görüntüleme ve Analiz Protokolleri

Summary

Beyin numune hazırlama, veri analizi ve görselleştirme, Bıçak-Kenar Tarama Mikroskobu kullanılarak seri kesit görüntüleme için tam bir süreç tarif edilir. Bu teknik şu anda fare beyni verileri elde etmek için kullanılan, ancak diğer organları, diğer türler için geçerli.

Abstract

Submicrometer çözünürlükte nöroanatomik veri geniş hacimli satın alma, yüksek verimlilik, yüksek çözünürlüklü, 3 boyutlu mikroskopi teknikleri büyük gelişmeler sağlamıştır. Tüm-beyin ölçekli veri üreten ilk bu tür araçların biri Knife-Edge Tarama Mikroskobu ^{(KESM) 7, 5,} 9, gelişmiş ve yazarların laboratuvar barındırılan . KESM, nöron ağları karmaşık ayrıntıları ^{(Golgi) 1, 4, 8,} damar ağları (Hindistan ^{mürekkep) 1, 4,} ve hücre gövdesi dağılımı ^(Nissl) 3 ifşa, bölüm ve tüm fare beyinleri submicrometer çözünürlükte görüntü için kullanılır olmuştur . KESM kullanımı, fare, ne de beyin sınırlı değildir. Biz başarıyla ahtapot beyin ^6, fare akciğer ve sıçan beyin görüntülü var. Şu anda tüm zebra balık embriyoları üzerinde çalışıyoruz. Mikrodolaşım ve hemodinamik araştırma; bu gibi veriler connectomics araştırma ¹⁰ büyük katkıda bulunabilir ve yazarlara stereology araştırmading bir zemin gerçeği tam.

Bu makalede, numune hazırlama (sabitleme, boyama ve gömme) dahil olmak üzere bir boru hattı, KESM konfigürasyon ve kurulum, kesit ve görüntüleme KESM ile, görüntü işleme, veri hazırlama ve veri analizi ve görselleştirme anlatacağız. Vurgu, numune hazırlama ve elde edilen KESM veri görselleştirme / analiz olacaktır. Biz bu yazıda ayrıntılı protokol KESM erişim ve kullanımını artırmak için genişletmeye yardımcı olmak için bekliyoruz.

Protocol

1. Örnek hazırlama: Golgi-Cox Bu protokol Mayerich ark protokol 7 yakından takip etmektedir. C57BL/6J fare izofluran uçucu anestezi ile derin anestezi ve daha sonra dekapite. Beyin Golgi Cox, fiksasyon solüsyonu (% 1 potasyum kromat,% 1 potasyum dikromat, ve deiyonize su içinde% 1 civa klorür) kaldırılır ve yerleştirilir. Beyin, 10 ila 16 hafta boyunca oda sıcaklığında, karanlıkta Golgi-Cox çözüm bırakılır. Beyinleri, karanlık bir gecede, deiyonize su ile durulanır. Durulanır beyin deiyonize su karanlıkta oda sıcaklığında 7 ila 10 gün için% 5 amonyum hidroksit çözeltisi batırılır. Bu uzun hazırlık süresi, siyah bir çökelti tamamen doku oluşturmak için bir şansı vardı, böylece bütün beynin infiltrasyonu sağlamak için. Beyin, 4 saat ve t oda sıcaklığında, deiyonize su ile tekrar durulanıroda sıcaklığında% 50 ve buzdolabında (4 ° C)% 70 ve% 85,% 95 (3 değişikliklerin) ve 100 (% 4 ila 5 değişiklik): etil alkoller kademeli serisi ile kurutulmuş tavuk. Beyni 24 saat boyunca her çözüm bırakılır. Susuz beyin sonra araldit-aseton oranı 1:2, 1:1, 2:1, ve nihayet bir araldit-aseton karışımı ile takip (3 ila 4 değişiklikleri, her bir gün için), aseton içinde alınır % 100 araldit buzdolabında (3 değişiklik, bir gecede her zaman), (4 ° C). Son olarak, tedavi beyin% 100 araldit gömülü ve 60 ° C'de 3 gün (bkz. Abbott ve Sotelo 2 gömme protokolü) kadar ısıtılır. Örnekleri LR Beyaz gömülü Eğer örnekleri önce polimerizasyon için standart bir prosedür her gece buzdolabında tutulur üç değişiklikler, LR Beyaz çözüm yoluyla, son% 100 etanol çözüm aktarılır. Üç tam infiltrasyonu sağlamak için yapılır. Örnek t60 yaşında, kapalı bir kap içinde polimerize taze LR Beyaz transfer tavuk ° C, 24 saat boyunca uygun polimerizasyon için gerekli zaman ve sıcaklık miktarıdır. Şekil 1 Araldite gömülü bir Golgi Cox lekeli beyin gösterir. Sonra tedavi örnek blok, epoksi kullanarak metal örnek halkası monte, ve blok tarafına (bkz. Şekil 2) gerektiği gibi kesilmiş. 2. Numune hazırlama: Nissl Ketamin ve ksilizin (1.7 mg ketamin / 20 gram vücut ağırlığı başına 0,26 mg ksilizin) intraperitoneal olarak enjekte kullanarak fare derin anestezi ve sonra oda sıcaklığında 50 ml transcardially kullanmadan perfüze fosfat tamponlu salin (pH, 7.4 ') 250 ml oda tarafından takip sıcaklık,% 10 nötr formalin tamponlu (pH, 7.4 '). ve son olarak 3.0 cc sulandırılmamış Hindistan mürekkep. Fiksatif ve tuzlu su ile bütün vücudu kardiyovasküler sistem perfüzyon kan temizlemek ve ti düzeltmek için gerekli ssues. Hindistan mürekkep ile Perfüzyon kardiyovasküler sistem damarsal tamamen doldurmak için gereklidir. Sonucu beyin kademeli etil alkoller (25% -100%), bir dizi sonra kurutulmuş ve daha sonra yukarıda 1,8-1,9 protokol araldit plastik gömülü. LR beyaz gömme ortamı ise, o zaman yukarıda 1.10 'da protokol izledi. 4. Numune hazırlama: Genel türleri, genel organlar Genel durum için, fiksasyon ya da% 10'luk nötral tamponlu formalin veya% 4 paraformaldehid ile yapılabilir. Küçük bir doku birimler için, difüzyon yerine perfüzyon fiksasyon ve boyama için tavsiye edilir. Küçük organizmalar veya organlar durumunda, ayrıca boyama dehidratasyon işlemi sırasında yapılabilir. Gömme protokolü çözüm infiltrasyon için organ veya tüm fare beyin çok daha küçük organizmalar için azaltılmış olmasına rağmen, yukarıdaki ile aynı. jove_title "> 5 KESM kurulum ve görüntüleme Pompa, sahnede açmak, kamera açmak, ışığını açın. Bıçak ve amaç kaldırın. Örnek yüzük takın. Ölçü numune boyut ve KESM Sahne Controller2 uygulama için bir yapılandırma dosyası oluşturmak. KESM Sahne Controller2 başlatın ve sahne başlatılamadı. Alt bıçak / amaç, pompa açın. Optik tren odaklanarak düğmeyi çevirerek ve bıçak kenarına göre kameranın görüş alanında ayarlayarak, objektif ve kamera odaklanın. Görüntüleme başlatmak için [] tuşuna basın. Bkz: Şekil. 3-8. 9, 7 teknik detaylar için bkz. 6. Görüntü işleme ve veri hazırlama KESM Yığın İşlemci çalıştırılabilir (00000, 00001, vb.) Yapılandırma dosya klasörü altında veri klasörünün içine kopyalayın. Aydınlatma artifakı kaldırmak ve tüm arka plan yoğunluğu normale KESM Yığın İşlemci çalıştırıngörüntüler. Tüm verileri alt klasörler için tekrarlayın. Veri ölçek fayans hazırlayın ayarlamak ve KESM Beyin Atlas web sunucu dosyalarını yükleyebilir ve kurmak. Bkz: Şekil. 9 – 7. Veri analizi ve görselleştirme KESM Beyin Atlası kullanarak Görselleştirme. Git http://kesm.cs.tamu.edu ve uygun atlas seçin. Google Maps gibi gidin. Google Maps gibi Yakınlaştırma ve uzaklaştırma. [-] Z derinliği arttırmak veya azaltmak için farklı bir derinlik gitmek için, ya da [+] veya üzerine tıklayın daha sonra açılan menüden her adımda ne kadar derin seçin ve. Açılan menüyü kullanarak bindirme sayısını ayarlayın. Açılan menü ile kaplamayı aralığı ayarlayın. Bkz: Şekil. 11. MeVisLab kullanarak Görselleştirme. MeVisLab başlatın. Yeni bir proje oluşturun. Aşağıda, yeni modüller ty oluşturmaya olabilirping komutu kutusunda modül adı. Oluştur modülü [Compose3Dfrom2DFiles], ve istediğiniz klasöre gidin. Dosya dize girin ve [GetFileList] tıklayın. Seçilen görüntüleri hafıza sığabilecek emin olun. [Create3D] birim oluşturmak için. Oluşturun modülü [SetWorldMatrix] ve altında "Ölçek" uygun voksel boyutu (0.6, 0.7, 1.0 10X 0.45NA bir amaç için) x, y, z "İlköğretim Dönüşümleri". Link [Compose3Dfrom2DFiles] [SetWorldMatrix]. Matrix ayarlayın ve "İleri", "Yoksay", "Yoksay", "Matrix Kompozisyon" altında Dönüşümler. Oluştur modülü [Arithmetic1] "(Max-Img) İnvert" "Fonksiyon" ayarlayın. Link [SetWorldMatrix] [Arithmetic1]. Oluştur modülü [View3D] ve [Arithmetic1] bağlayın. View3D, sağ fare tuşu basılı iken, ayarlayabilirsiniz.Özellik etrafında fareyi hareket ettirin. Bölgeler, değişimin yönünü (sol fare tuşu basılı iken hareket fare), değişim aydınlatma (hacim renderin kırpabilirsinizg veya MIP), vb / arka plan kapatmak Bkz: Şekil. 10. 8. Temsilcisi Sonuçlar: Burada, bütün beyin veri ve detay sunuyoruz. İncir. 12-15 gösterisi Hindistan Mürekkep, Golgi, tüm beyin ve Nissl veri, 1, 4, 3 ayarlar . Şekil 1, Sabit, lekeli, ve gömülü fare beyin Şekil 2. Gömülü fare beyin örnek numune halkası üzerine monte edilmiş. Şekil 3 Knife Edge Tarama Mikroskobu (KESM). Önemli bileşenleri işaretli bir fotoğrafı KESM gösterilir: (1) yüksek hızlı hat-tarama kamera, (2) mikroskop objektif, (3) elmas bıçak montaj ve ışık kolimatör, (4) SPEÇimen tankı (su altında kalacak görüntüleme için) (5) üç-eksenli hassas hava taşıyan sahne, (6) beyaz ışık mikroskobu aydınlatıcı, (7) kesitli dokusunun çıkarılması için su pompası (arka), (8) sahne kontrolü ve görüntü alımı, (9) granit taban, ve (10) granit köprü için PC sunucu. Şekil 4 KESM Görüntüleme ilkeleri. KESM çalışma başlıca gösterilmiştir. Objektif ve bıçak örnek ise 20 nm ve 1-5 seyahat hızı çözünürlükte konumlandırma aşamasında hamle (düz çizgi ile ok) yapıştırılmış (5 mm genişliğinde, bir yerde tutulur ve elmas bıçakla karşı kazınarak alır 10X objektif), bıçak (düz çizgi ile ok) üzerinden akan ince bir bölümü oluşturuyor. Line-tarama görüntüleme bıçak ucuna yakın yapılır. Şekil 5KESM kamera ve objektif odaklama kontrolleri. Şekil 6 KESM bıçak montaj ve kontrolleri. Şekil 7 gözlem bağlantı noktası üzerinden odaklama İlk. Şekil 8 KESM Sahne Controller 2 uygulama (ekran görüntüsü). Şekil 9 KESM yığın işlemci uygulamasını (ekran görüntüsü). Şekil 10 MeVisLab uygulama (ekran görüntüsü). <br/> Şekil 11 KESM Beyin Atlas: Web arayüzü (ekran görüntüsü). Şekil 12 KESM bütün beyin Hindistan mürekkep veri. KESM veri yığınlarının Cilt görselleştirme vasküler veri seti için gösterilmiştir. (A) Yakın çekim vasküler veri. Genişlik ~ 100 um. (Bd) tüm fare beynin damarsal Üç standart görünümler (yüksek çözünürlüklü veri alt örneklendirilmiştir). Genişlik 10mm ~. Şekil 13 KESM tüm beyin fare Golgi veri. Şekil 14 KESM Golgi veri ayrıntılar. Şekil 15 KESM tüm beyin Nissl veri. K (a) Yakın çekimissl veri. ~ 300 um 3. (Bd) tüm fare beyin Nissl veri Üç standart görünümler (yüksek çözünürlüklü veri alt örneklendirilmiştir). Kesit iç yapıları net bir şekilde görmek için gösterilmiştir.

Discussion

KESM biyolojik numune (~ 1 cm ³⁾ geniş hacimli bir submicrometer düzeyinde araştırma için izin verir. Bu tür hacim, beyin, akciğer, kalp, böbrekler gibi tüm küçük hayvan organları, tutmak için yeterli, vb benzeri görülmemiş bu organların yapısal organizasyon hakkında niceliksel bilgi sağlamak ve çeşitli fonksiyonel sayısal modelleme etkinleştirmek gibi organların görüntüleri Taranmış devre ve ağ dinamiği, elektriksel özellikleri, sıvı ve hava akış dinamikleri, ve kas dinamikleri de dahil olmak üzere bu organların yönleri.

Bu makalede ayrıntılı olarak numune hazırlama protokolü ve analiz sonrası protokol KESM kolay erişim ve ortaya çıkan veriler araştırma grupları dışında yardımcı olması beklenmektedir. KESM çalışma protokolü, bu benzersiz bir görüntüleme yönteminin yararları ve sınırlamaları takdir bu dış araştırmacılar yardımcı olacaktır.