Mudando a direção e orientação do campo elétrico Durante Elétrica Aplicação Pulsos melhora a transferência de Gene Plasmid In vitro</em
Summary
Transfecção gênica por eletroporação é melhorada aproximadamente duas vezes quando a orientação do campo elétrico é alterado durante a aplicação do pulso, enquanto que a viabilidade das células não é afetado. O aumento da transfecção do gene é causada pelo aumento da área de membrana que é feito competentes para a entrada de DNA na célula.
Abstract
Gene electrotransfer é um método físico utilizado para entregar genes dentro das células através da aplicação de curto e intenso pulsos elétricos, que causam a desestabilização da membrana celular, tornando-a permeável a pequenas moléculas e permite a transferência de grandes moléculas como o DNA. Ela representa uma alternativa aos vetores virais, devido à sua eficácia, segurança e facilidade de aplicação. Para o gene electrotransfer diferentes protocolos de pulso elétrico são utilizadas a fim de alcançar transfecção gênica máximo, um deles está mudando a direção do campo elétrico e orientação durante a entrega de pulso. Mudando de direção e orientação do campo elétrico aumentar a área de membrana competentes para a entrada de DNA na célula. Neste vídeo, demonstramos a diferença na eficácia electrotransfer gene, quando todos os pulsos são entregues na mesma direção e quando os pulsos são entregues mudando alternadamente a direção do campo elétrico e de orientação. Para esta dica propósito com eletrodos integrados e de alta tensão do gerador protótipo, que permite a mudança do campo elétrico em diferentes direções durante a aplicação do pulso elétrico, foram usados. Gene electrotransfer eficácia é determinada 24h após a aplicação do pulso como o número de células expressando a proteína fluorescente verde dividido com o número de todas as células. Os resultados mostram que a transfecção de genes é aumentada quando a orientação do campo elétrico durante o parto pulso elétrico é alterado.
Protocol
Discussion
Gene electrotransfer é uma técnica de biotecnologia versátil que permite a transferência de DNA em células por meio de aplicação de curto, pulsos de alta tensão elétrica 3 e representa uma alternativa mais segura para vetores virais, devido à sua eficácia, segurança e facilidade de aplicação. Embora electrotransfer gene hoje é amplamente utilizado para transfecção todos os tipos de células e primeira fase I de ensaios clínicos utilizando este método tem sido relatada 4, os mecan…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Agência de Pesquisa esloveno (projeto J2-9770, IP-0510 centro de infra-estrutura e programa P2-0249). Este vídeo representa material suplementar para o "Eletroporação baseado em Tecnologias e Tratamentos" workshop científico e pós-graduação, organizado pela Faculdade de Engenharia Elétrica da Universidade de Ljubljana, na Eslovénia. Autores agradecem também DUSA Hodzic por ter gentilmente cedido DNA plasmidial.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| HAM-F12 | PAA | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom made | ||
| electric pulse generator | Custom made | ||
| 6 well plate | TPP | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | TPP | 90076 |
Referenzen
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