חשיפת טופוגרפיה מעגלים עצביים Multi-Color
Summary
אנו מספקים מדריך מעשי קליעים נותבים מתן<em> In vivo</em> ולהשתמש מסלול spinocerebellar כמודל למערכת להפגין צעדים חיוניים לניתוח מוצלח מעגלים עצביים בעכברים. אנו מתארים בפירוט פרוטוקול צדדי שלנו התחקות המנצלת נבט חיטה agglutinin (WGA) מצומדות כדי fluorophores אלקסה.
Abstract
מעגלים עצביים מאורגנים מפות טופוגרפיות תפקודית. כדי להמחיש אדריכלות מעגל מורכב פיתחנו גישה אמינה התווית דפוסים גלובליים של תחזיות הטופוגרפי מרובים. המוח הקטן הוא מודל אידיאלי ללמוד את הסדר מסודר של מעגלים עצביים. לדוגמה, ארגון compartmental של סיבי אזובי spinocerebellar הוכיחה להיות מערכת הכרחית ללימוד דפוסים סיבים טחב. אנחנו לאחרונה הראה כי נבט חיטה agglutinin (WGA) מצומדות כדי אלקסה 555 ו – 488 יכול לשמש התחקות spinocerebellar תחזיות סיבים אזובי בפיתוח עכברים בוגרים (Reeber et al. 2011). מצאנו שלושה מאפיינים עיקריים להפוך את WGA-Alexa כלים קליעים נותבים רצוי תיוג תחזיות עצביים. ראשית, fluorophores אלקסה הם אינטנסיבי הבהירות שלהם מאפשר הדמיה wholemount ישירות לאחר מעקב. שנית, WGA-Alexa קליעים נותבים התווית מסלול שלם של פיתוח מבוגר עצביים projections. שלישית, WGA-Alexa קליעים נותבים מועברים במהירות לשני הכיוונים מדרדר ו אנטרוגרדית. כאן, אנו מתארים בפירוט כיצד להכין את קליעים נותבים והכלים הנדרשים אחרות, כיצד לבצע את הניתוח עבור מעקב spinocerebellar ו מהי הדרך הטובה ביותר לעקוב אחר תחזיות תמונה בשלושה ממדים. לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד התחקות כי יהיה שימושי עבור בפענוח ארגון וקישוריות של מפות פונקציונלי ולא רק במוח הקטן, אלא גם בקליפת המוח, גזע המוח, וחוט השדרה.
Protocol
Discussion
תיארנו את הפרטים ניתוח טכני נדרש מעקב axonal ו דנדריט מוצלח באמצעות גישה חדשנית מבוססת פלורסנט עבור במהירות תיוג תחזיות עצביים בפיתוח עכברים בוגרים. באמצעות WGA-Alexa אנו מראים כיצד קליעים נותבים וסמנים יכול לשמש לניתוח הטופוגרפיה בדוגמת המעגל ברזולוציה גבוהה בשלושה ממדי…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי חוקר חדש הזנק כספים אלברט איינשטיין קולג 'לרפואה של הישיבה יוניברסיטי כדי RVs.
Materials
| Equipment/Reagents | Model/Catalogue number | Company |
| Bead sterilizer | Model Steri 250 Cat. # 18000-45 | Fine Science Tools |
| Cauterizer | Cat. # 18000-00 | Fine Science Tools |
| Borosilicate glass capillaries | Cat. # 300056 | Harvard Apparatus |
| Dual stage Glass Micropipette Puller | Model 001-PC-10 | Narishige |
| Micrometer syringe | Cat. # GS-1100 | Gilmont Instruments |
| Small Animal Stereotaxic Instrument | Model 940-A | Kopf Instrumentation |
| Electrode Manipulator | Model 960 | Kopf Instrumentation |
| Vetcare chamber | Cat. # 340508 | Harvard Apparatus |
| Heating Pad | Cat. # 341241 | Harvard Apparatus |
| Leica DFC360 FX camera | DFC360 FX | Leica |
| Leica DFC490 camera | DFC490 | Leica |
| Leica DM5500 microscope | DM5500 | Leica |
| Leica DFC3000 FX camera | DFC3000 FX | Leica |
| Leica MZ16 FA microscope | MZ16 FA | Leica |
| CY3 Filter | Model # 11600231 | Leica |
| FITC Filter | Model # 11513880 | Leica |
| A4 DAPI/UV filter | Model # 11504162 | Leica |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate | Cat. #W11261 | Invitrogen |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate | Cat. #W32464 | Invitrogen |
Referenzen
- Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
- Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).
- Mesulam, M. . Tracing neural connections with horseradish peroxidase. , (1982).
- Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
- Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain. Struct. Funct. , (2011).
- Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum. J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).
- Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map. J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).
- Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells. Neurowissenschaften. 130, 735-744 (2005).
- Vogel, M. W., Prittie, J. Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant. J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).
- Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems. Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).
- Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei. J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).
