إعداد أقراص سليمة الذيل البقري الفقرية للثقافة الجهاز
Summary
يوضح هذا البروتوكول تقنية حصاد للأقراص الفقرية العصعصية البقري للثقافة الجهاز لل<em> في المختبر</em> الجهاز الثقافة.
Abstract
القرص بين الفقرات (IVD) هو مشترك في العمود الفقري لربط فقرة فقرة. وهو يعمل على إحالة التحميل للعمود الفقري واعطاء المرونة للعمود الفقري. انه يؤلف من ثلاث مقصورات : النواة اللبية الأعمق (NP) التي تضم الحلقة الليفية (AF) ، واثنين endplates غضروفية تربط NP وAF الفقري للجسم على كلا الجانبين. وقد تم تحديد الألم قرصي المنشأ الذي ربما حدث بسبب الأمراض التنكسية القرص الفقرية (DDD) وفتوق القرص باعتباره مشكلة رئيسية في مجتمعنا الحديث. لدراسة الآليات الممكنة للانحطاط IVD ، في نظم المختبر مع خلايا الجهاز الثقافة قرص العيش وجذابة للغاية. تقدمت في المختبر من ثقافة سليمة IVDs العصعصية الأبقار إلى نظام النموذجية ذات الصلة ، والتي تسمح بدراسة الجوانب البيولوجية mechano في بيئة جيدة للرقابة الفسيولوجية والميكانيكية. ويمكن الحصول على IVDs ذيل الأبقار سهلة نسبيا في ارتفاع أعداد anد متشابهة الى حد بعيد في IVDs القطني الإنسان فيما يتعلق كثافة الخلية ، والسكان ، وأبعاد الخلية. ومع ذلك ، فشلت البقري الذيلية السابقة تقنيات حصاد IVD الاحتفاظ endplates الغضروفية العظمية وendplates بعد 1-2 أيام من الثقافة منذ سدت الواضح مسارات التغذية عن طريق الدم متخدر. IVDs هي أكبر الأجهزة اوعائي ، وبالتالي ، فإن المواد الغذائية إلى الخلايا في NP تعتمد فقط على نشر عبر البراعم الشعرية من جسم الفقري المتاخمة لها. يمكن وجود حطام العظام والدم المتجلط على السطوح endplate تعرقل نشر المواد الغذائية في مركز القرص وسطا بقاء الخلية. أنشئت مجموعتنا بروتوكول سريع نسبيا "الكراك" التدريجي للIVDs من الذيل مع مخاطر منخفضة للتلوث. ونحن قادرون على permeabilize وطازجة وقطع الأسطح endplate العظمية باستخدام طائرة غسيل جراحية النظام ، الذي يزيل الجلطات الدموية والحطام وقطع بكفاءة عالية تعيد فتح ممر نشر التغذيةللوسط IVD. وجود لوحات النمو على جانبي العمود الفقري والعظام التي ينبغي تجنبها ، ويمكن إزالتها قبل الثقافة. في هذا الفيديو ، ونحن الخطوط العريضة للخطوات حاسمة خلال إعداد وشرح المفتاح لنجاح الجهاز ثقافة الحفاظ على سلامة الخلية عالية لمدة 14 يوما في ظل ثقافة تورم الحرة. ويمكن تمديد الوقت الذي يمكن فيه ثقافة الحفاظ على البيئة المناسبة الميكانيكية باستخدام مفاعل حيوي ميكانيكية التحميل. ويمكن تمديد هذه التقنية أثبتت هنا لأنواع الحيوانات الأخرى مثل الخنزير والأغنام والعزلة جذامي IVD الذيلية والقطنية.
Protocol
Discussion
الخطوة الأولى للثقافة الجهاز الناجح هو للتأكد من أنه لا ينبغي أن تكون ملوثة يزدرع. وينبغي أن البشرة الذيل قبل البدء لهذا الإجراء. يمكن لأي وبر جلبت الى مختبر معقم يكون إشكاليا من حيث التلوث. وينبغي أن يكون الذيل البقري الطازج مثالي ممكن (وهذا يؤثر على بقاء الخلية الأو?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أيد هذا المشروع من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (SNF 310030-127586/1 #).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack does also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton, England | #10: 0201 #22: 0208 |
|
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 |
|
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen, Switzerland | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco, Switzerland | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | TPP, Switzerland | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible | ||
Referenzen
- Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).
- Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture. Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).
- Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion. Spine (Phila Pa 1976). , (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers. Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds. Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system. Spine. 31, 2918-2925 (2006).
- Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs. Spine. 31, 2665-2673 (2006).
- Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent. J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).
- Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology. Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).
- Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential. European Spine Journal. , 1-11 (2011).
