kinesin的分离和纯化果蝇胚胎
Summary
这是一个协议隔离积极全长驱动蛋白<em>果蝇</em>单分子生物物理研究的胚胎。我们如何收集胚胎，使胚胎裂解，然后聚合微管（MTS）。动蛋白纯化固定在MTS，纺纱动蛋白吨复合物，然后释放从MTS动蛋白通过磷酸腺苷此外。
Abstract
马达蛋白沿着微管移动的货物，并运送到特定的亚细胞位置。由于改变交通建议多种神经退行性疾病的基础，了解微管的汽车运输及其调控最终可能会导致更好的治疗方法。动蛋白是真核细胞马达蛋白在ATP水解供电，沿微管（MTS）顺（加末）的方向移动。在这里，我们报告了详细的净化从果蝇胚胎中分离的积极全长kinesin的协议，从而使单分子生物物理研究果蝇遗传学相结合。拥有大约1000名女性，每杯，约50铺设杯开始，我们进行了隔夜的集合。这提供了约10毫升装的胚胎。胚胎漂白dechorionated（产生的胚胎约9克），然后均匀。 AF之三的破坏，匀浆，利用低速旋转，由高速离心澄清。澄清的上清液治疗GTP和紫杉醇微管聚合。动蛋白聚合微管上，通过增加ATP的模拟在室温下，5'-腺苷酸imidodiphosphate固定。 kinesin的绑定后，微管沉降的通过通过蔗糖坐垫高速离心。微球，然后再暂停，并重复此过程。最后，ATP的释放从MTS动蛋白。高速离心，然后降速MTS，留在上清动蛋白。这kinesin的使用100第纳尔切断进一步净化过滤离心过滤，分装，捕捉液氮冷冻，储存在-80°C。使用纯化的样品进行SDS凝胶电泳和免疫印迹。最后离心过滤步骤之前和之后的纯化的样品电机活动在体外单分子微管法进行了评估。离心过滤前后动蛋白组分显示processivity以前文献报道。进一步的实验正在进行评估动蛋白和其他运输相关的蛋白质之间的相互作用。
Protocol
Discussion
牛脑是最广泛使用的起始原料11净化全长kinesin的，虽然小鼠的大脑已被使用，以及12。使用牛脑动蛋白源作为一个大的缺点是新鲜的起始原料的可用性：屠宰场通常无法进入，必须非常新鲜，以取得积极的kinesin的大脑。此外，青年奶牛的大脑是有效的。最后，牛的基因操纵，目前没有一个可行的选择，所以只有野生型的蛋白质进行研究。
小鼠更容易，但收获?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
特别感谢克里斯艺和贾森德尔里奥在这个项目的支持和援助。这项工作被授予GM070676石药RO1的支持。
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher | D16-3 | |
| Petri Dishes | Becton | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesse Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5′-adenylyl imidodiphosphate | Sigma | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | Millipore | UFC510008 |
Referenzen
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