وصفت وهناك تقنية للتحقيق في تقسيم مجموعة كبيرة من البروتينات الشحمية فلوري في الغشاء البلازمي للخلايا الحية. فإنه يستفيد من التفاوت في أوقات نشر من البروتينات الموجودة داخل أو خارج من الطوافات الدهنية. لا يمكن أن يؤديها اكتساب حيوي في ظروف سيطرة أو بعد إدمان المخدرات.
في السنوات الخمس عشرة الماضية أصبحت فكرة أن أغشية الخلايا ليست متجانسة والاعتماد على microdomains لممارسة وظائفها بقبول واسع النطاق. الطوافات الدهنية هي microdomains غشاء المخصب في الكولسترول وsphingolipids. انها تلعب دورا في العمليات الفيزيولوجية الخلوية مثل الإشارات، و1،2 الاتجار لكن يعتقد أيضا أن يكون لاعب رئيسي في العديد من الأمراض بما في ذلك العدوى الفيروسية أو البكتيرية وأمراض الاعصاب 3.
بعد وجودها لا يزال مثار جدل 4،5. في الواقع، فقد قدر حجم الدهون طوف أن يكون حوالي 20 نانومتر 6، حتى في إطار الحد الأقصى من قرار المجهري التقليدية (حوالي 200 نانومتر)، مما حال دون التصوير المباشر. حتى الآن، وكانت التقنيات الرئيسية المستخدمة لتقييم قسم من البروتينات ذات الاهتمام داخل الطوافات الدهنية أغشية مقاومة للمنظفات (DRMS) العزلة وشارك في التصحيح، مع الأجسام المضادة. على الرغم من استخدامها على نطاق واسع بيكاوكانت هذه التقنيات استخدام تنفيذها سهل نوعا ما، عرضة لالمصنوعات اليدوية، وانتقد وبالتالي 7،8. وكانت التحسينات التقنية اللازمة لذلك للتغلب على هذه المصنوعات اليدوية، وتكون قادرة على تحقيق دهن الطوافات التقسيم في الخلايا الحية.
هنا نقدم طريقة لتحليل الحساسية من تقسيم الطوافات الدهنية من البروتينات fluorescently الموسومة أو الدهون في الغشاء البلازمي للخلايا الحية. هذا الأسلوب، ووصف الإسفار الارتباط الطيفي (FCS)، تعتمد على تفاوت في الأوقات نشر تحقيقات نيون الواقعة داخل أو خارج من الطوافات الدهنية. في الواقع، كما يتضح في كل من الأغشية الاصطناعية والثقافات الخلية، ونشر تحقيقات أسرع بكثير خارج من داخل الطوافات الدهنية الكثيفة 9،10. لتحديد الأوقات ونشرها، وتقاس التقلبات مضان دقيقة بوصفها وظيفة من الوقت في وحدة التنسيق (ما يقرب من 1 فيمتولتر)، التي تقع في الغشاء البلازمي للخلايا مع المجهر متحد البؤر (الشكل1). ويمكن بعد ذلك منحنيات لصناعة السيارات في ارتباط يمكن استخلاصها من هذه التقلبات ومزودة نماذج ملائمة لنشر الرياضية 11.
ويمكن استخدام FCS لتحديد مجموعة كبيرة من الدهون تقسيم تحقيقات مختلفة، طالما يتم تمييزها fluorescently هم. لا يمكن أن يتحقق عن طريق وضع علامات فلوري التعبير عن البروتينات الانصهار فلوري أو عن طريق الربط من يغاندس فلوري. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام FCS ليس فقط في الأغشية الاصطناعية وخطوط الخلية ولكن أيضا في الثقافات الأولية، كما هو موضح في الآونة الأخيرة 12. ويمكن أيضا استخدامه لمتابعة ديناميكية تقسيم طوف الدهون بعد إضافة عقار أو تغيير تكوين الغشاء الدهني 12.
طريقة FCS المقدمة هنا يمكن تحليل الحساسة والسريعة للدهن تقسيم مجموعة من المجسات فلوري من الاهتمام في الخلايا الحية. FCS يجمع بين دقة الترجمة من متحد البؤر المجهري مع حساسية العد فوتون واحد. والفرق الرئيسي بين السفح والتقنيات الحيوية هو معيار أن FCS تمكن من تحديد المطلقة ?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل عن طريق منحة من الوكالة الوطنية للبحوث دي لا (ChoAD). ونحن أيضا ممتنون لمؤسسة اي سي ام (معهد دو Cerveau آخرون دي لا Moelle) لما قدموه من دعم مالي.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Cholera toxin subunit B-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | MW (pentamer) = 57 kg/mol |
Confocal microscope | Leica | SP5 | |
Incubator for temperature and CO2 control | Life imaging services | The Cube and the Box | |
SPAD (Single Photon Avalanche Diode) | MPD (Micro Photon Devices) | PDM serie (100 μm sensitive area) | |
High pass 488 nm filter | Semrock | 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25 |
|
FCS detection unit | Picoquant | Picoharp 300 module | |
Acquisition and auto-correlation software | Picoquant | SymPhoTime | |
Fitting software | OriginLab | OriginPro8 |