Genomics vírus individuais (SVG) é um método para isolar e amplificar os genomas de virons individuais. Suspensões virais de uma assembléia mista são classificados usando citometria de fluxo em uma lâmina de microscópio com poços discretos contendo agarose, capturando assim, o virion e reduzindo corte genoma durante o processamento downstream. Amplificação do genoma inteiro é conseguida usando vários amplificação por deslocamento (MDA), resultando em material genómico que é adequado para a sequenciação.
Abstract
Amplificação e seqüenciamento do genoma inteiro das células microbianas individuais permite a caracterização genômica, sem a necessidade de cultivo 1-3. Os vírus, que são onipresentes e as mais numerosas entidades em nosso planeta 4 e importante em todos os ambientes 5, têm ainda a ser revelado através de abordagens semelhantes. Aqui nós descrevemos um método para isolar e caracterizar os genomas de virions single chamado 'Genomics Vírus único »(SVG). SVG utiliza a citometria de fluxo para isolar os vírus de amplificação individuais e todo o genoma para obter ADN genómico de elevado peso molecular (gDNA), que pode ser utilizado em reacções de sequenciação subsequentes.
Protocol
1. Preparação de suspensões virais Antes de isolamento do vírus da única via citometria de fluxo, preparar suspensões virais não corrigidos. Isolar as partículas virais utilizando protocolos previamente estabelecidos, tornando-se a suspensão virai final, está contida em 0,1 micrometros de filtrado de TE (Tris-EDTA, pH 8). Recomendamos o uso de filtração de fluxo tangencial (TFF) se aproxima 6 embora outros métodos foram desenvolvidos que uso de produtos qu?…
Discussion
Uma série de fatores importantes devem ser levados em consideração na aplicação de abordagens SVG. Genotipagem, que foi realizada durante o experimento prova-de-conceito 13, não é uma opção válida para os isolados ambientais ou desconhecidos como iniciadores conservados não estão disponíveis em todos os grupos virais. Além disso, a síntese de ADN de fundo, ou a amplificação não específica é comumente avaliado durante a amplificação usando a reacção do MDA 14. Amplificação …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Ken Nealson por sua visão e aconselhamento ao longo do processo de preparação do manuscrito.
Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
Zeigler Allen, L., Ishoey, T., Novotny, M. A., McLean, J. S., Lasken, R. S., Williamson, S. J. Isolation and Genome Analysis of Single Virions using ‘Single Virus Genomics’. J. Vis. Exp. (75), e3899, doi:10.3791/3899 (2013).