Planaria immobilizzazione, irradiazione parziale, e di tessuti
Summary
Un metodo efficace per l'innesto di tessuto di dimensione definita e coerente tra planaria è descritto. È inclusa anche una descrizione di come la tecnica di immobilizzazione utilizzata per il trapianto può essere adattato, in combinazione con scudi piombo, per l'irradiazione parziale di animali vivi.
Abstract
La planaria, un verme piatto d'acqua dolce, ha dimostrato di essere un potente sistema per la rigenerazione dei metazoi dissezione e la biologia delle cellule staminali 1,2. Rigenerazione planaria di eventuali tessuti mancanti o danneggiate è resa possibile da cellule staminali adulte chiamato neoblasts 3. Anche se queste cellule staminali sono state definitivamente dimostrato di essere pluripotenti e singolarmente in grado di ricostituire un animale intero 4, l'eterogeneità all'interno della popolazione di cellule staminali e le dinamiche dei loro comportamenti cellulari rimangono in gran parte irrisolti. A causa del numero elevato e ampia distribuzione di cellule staminali in tutto il corpo piano planarian, metodi avanzati per manipolare sottopopolazioni di cellule staminali per lo studio molecolare e funzionale in vivo sono necessari.
Trapianto di tessuti e di irradiazione parziale sono due metodi con cui una sottopopolazione di cellule staminali planaria possono essere isolati per ulteriori studi. Ogni tecnica ha i suoi vantaggi distinti. Ttrapianto questione permette l'introduzione di cellule staminali, in un ospite ingenuo, che sono intrinsecamente o geneticamente distinte o sono stati precedentemente trattati farmacologicamente. In alternativa, irradiazione parziale consente l'isolamento di cellule staminali all'interno di un host, giustapposti al tessuto privo di cellule staminali, senza l'introduzione di una ferita o culatta in integrità dei tessuti. Utilizzando questi due metodi, si può indagare sui fattori cellulari autonomi e non autonomi che controllano le staminali funzioni cellulari, quali la proliferazione, la differenziazione e la migrazione.
Sia il trapianto di tessuti 5,6 e l'irradiazione parziale 7 sono state utilizzate storicamente nella definizione molte delle domande circa la rigenerazione planaria che rimangono in fase di studio oggi. Tuttavia, queste tecniche sono rimaste sottoutilizzate a causa della natura laboriosa e incoerente dei metodi precedenti. I protocolli presentati qui rappresentano un grande passo in avanti nel ridurre il tempo di unond sforzo necessario per generare in modo riproducibile un gran numero di animali innestati o parzialmente irradiato con efficacie che si avvicinano al 100 per cento. Copriamo la cultura degli animali di grandi dimensioni, l'immobilizzazione, la preparazione per l'irradiazione parziale, il trapianto di tessuti, e l'ottimizzazione del recupero degli animali. Inoltre, il lavoro qui descritto dimostra la prima applicazione del metodo irradiazione parziale per l'uso con la planarian più ampiamente studiato, Schmidtea mediterranea. Inoltre, il tessuto efficiente innesto in planaria apre la porta per il test funzionale di sottopopolazioni di cellule staminali naive o trattati in saggi di ripopolamento, che ha da tempo il metodo di gold-standard di saggiare il potenziale delle cellule staminali dell'adulto nei mammiferi 8. Ampia adozione di queste tecniche sarà senza dubbio portato ad una migliore comprensione dei comportamenti cellulari di cellule staminali adulte durante l'omeostasi dei tessuti e la rigenerazione.
Protocol
Discussion
Importanza di immobilizzazione
L'immobilizzazione è di gran lunga il passo più critico per il completamento di qualsiasi di questi processi. Se planaria sono impropriamente immobilizzati prima dell'irradiazione parziale, possono muoversi sotto lo scudo di piombo, producendo risultati inconsistenti e confusione. Inoltre, se gli animali sono sufficientemente immobilizzati dopo il trapianto, il verme host probabilmente allontanarsi dal tessuto innesto, con conseguente fallimento del trap…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Chiyoko Kobayashi e Kiyokazu Agata per utili consigli sul trapianto di planaria così come i membri passati e presenti del laboratorio per le discussioni Sánchez preziosi durante lo sviluppo di queste tecniche. Questo lavoro è stato supportato dal NIH Training Grant (5T32 HD0791) per OCG e NIH R37GM057260 ad ASA. ASA è un Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| General Purpose Transfer Pipette | Samco | 691 |
| Capillary tubes (ID 0.75 mm) | FHC | 30-30-0 |
| Capillary tubes (OD 0.7 mm) | FHC | 30-50-08 |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 |
| Kimwipes 34155 | VWR | 500029-891 |
| Black filter paper | Schleicher & Schuell | 10310809 |
| Whatman #2 filter paper 1002-055 | Fisher Scientific | 09-810B |
| Whatman #3 filter paper 1003-185 | Fisher Scientific | 09-820E |
| Cigarette rolling paper | Zig-Zag, original | NA |
| Petri dishes | VWR | 82050-544 |
| Forceps DUMONT, INOX #5 | FST | 11251-20 |
| Chloretone | Sigma Aldrich | 112054 |
| Casein | Sigma Aldrich | C3400 |
| Lead Shields | Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT | Custom design |
| XRAD-320 Biological Irradiator | Precision X-Ray, North Branford, CT | NA |
Referenzen
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