Charakterisierung der molekularen Mechanismen der<em> In vivo</em> UVR Induced Cataract
Summary
Grauer Star ist die häufigste Ursache für Erblindung in der Welt. Ultraviolette Strahlung der Sonne (UV) ist der Hauptrisikofaktor für die Katarakt-Entwicklung. Ein Tiermodell von weit UVR-B induzierte Katarakt entwickelt. In diesem Artikel beschreiben wir Methoden für die Untersuchung der Entstehung von grauem Star: Exposition gegenüber UV-Strahlung, quantitative RT-PCR und Immunhistochemie.
Abstract
Grauer Star ist die häufigste Ursache für Erblindung in der Welt ein. Die Weltgesundheitsorganisation definiert Katarakt als einer Trübung der Linse des Auges, die die Übertragung von Licht behindert. Grauer Star ist eine multifaktorielle Erkrankung mit Diabetes, Rauchen, UV-Strahlung (UVR), Alkohol, ionisierende Strahlung, Steroide und Hypertonie. Es gibt starke experimentelle 2-4 und epidemiologische Evidenz 5,6, dass UVR Katarakt verursacht. Wir entwickelten ein Tiermodell für UVR B induzierten Katarakt sowohl betäubt 7 und nicht-narkotisierten Tieren 8.
Das einzige Heilmittel für die Katarakt-Chirurgie ist aber diese Behandlung ist nicht für alle zugänglich. Es wurde geschätzt, dass eine Verzögerung des Einsetzens von Katarakt für 10 Jahre könnte die Notwendigkeit für die Kataraktchirurgie um 50% 9 zu reduzieren. Um das Auftreten von Katarakt verzögern, ist es notwendig, die Mechanismen der Entstehung von grauem Star zu verstehen und wirksame Prävention Strategiegien. Unter den Verfahren zur Kataraktentwicklung spielt Apoptose eine wichtige Rolle bei Einleitung von Katarakt bei Menschen und Tieren 10. Wir konzentrieren uns wurde kürzlich Apoptose in der Linse als Mechanismus zum Kataraktentwicklung 8,11,12. Es wird erwartet, dass ein besseres Verständnis der Wirkung von UV-Strahlung auf der Apoptoseweg werden Möglichkeiten für die Entdeckung neuer Arzneimittel zu verhindern Katarakt liefern.
In diesem Artikel beschreiben wir, wie Katarakt kann experimentell durch in vivo Exposition gegenüber UVR-B induziert. Weitere RT-PCR und Immunhistochemie dargestellt als Werkzeuge zur molekularen Mechanismen von UVR-B induzierte Katarakt studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Papier beschreibt Methoden, die Untersuchung der molekularen Ereignisse, die während UVR-B induzierte Katarakt ermöglichen.
In Anbetracht, dass die meisten Informationen für in vivo UVR induzierten Katarakt aus Experimenten an Albino-Sprague-Dawley-Ratten 7, 16, 17, 18, 19 abgeleitet wurde, beschlossen wir, die Albino-Sprague-Dawley-Ratte in der aktuellen Studie zu verwenden. Alter der Ratten betrug sechs Wochen alte. Das Geschlecht wurde gewählt, w…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse: Diese Arbeit wurde von der Karolinska Institutet KID-Finanzierung, Swedish Radiation Protection Authority, Karolinska Institutet Eye Research Foundation, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, St. Eriks Eye Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Ketalar | Pfizer | 150086 | 50 mg/ml |
| Rompun | Bayer | 022545 | 20 mg/ml |
| Oculentum Simplex | Apoteket, Sweden | 336164 | 5 g |
| Mydriacyl | Alcon | 00352 | 10 mg/ml |
| Balanced salt solution | Alcon | 0007950055 | |
| 3.5 ul β-mercaptoethanol | |||
| NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit | Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany | 740955.50 | |
| p53 DNA specific primers | biomers.net GmbH | Custom made | |
| Taq DNA polymerase, dNTPack | Roche | 04 728 866 001 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml | Sigma | E1385 | |
| Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer | NanoDrop Products | ||
| 1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) | Roche Diagnostics GmbH | 11 483 188 001 | |
| iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system | Bio-Rad Laboratories | ||
| 96-well plate | Sarstedt | 72.1979.202 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 | Applied Biosystems | Rn00563902_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for 18s | Applied Biosystems | Hs99999901_s1 | |
| MyiQ software | Bio-Rad Laboratories | ||
| Cleaved caspase-3 (Asp175) | Cell signaling technology | 9661 | |
| Anti rabbit IgG | Abcam | Ab6798 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | ||
| Universal Microscope Axioplan 2 Imaging | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| TBE buffer 10x | Promega | V4251 |
Referenzen
- Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
- Jose, J. G., Pitts, D. G. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure. Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).
- Söderberg, P. G. Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure. Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).
- Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR – B induced cataract in C57BL/6J mice. Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).
- McCarty, C., et al. Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project. Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).
- Sasaki, H., et al. Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).
- Söderberg, P. G. Experimental cataract induced by ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, 1-77 (1990).
- Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis. Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).
- McCarty, C. A., Taylor, H. R. A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).
- Li, W. C., et al. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).
- Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).
- Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure. Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).
- Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. A new universal rat restrainer for ophthalmic research. Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation. Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).
- Söderberg, P. G., et al. Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD). Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).
- Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).
- Löfgren, S. . Cataract from ultraviolet radiation. , (2001).
- Ayala, M. N. . Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract. , (2005).
- Dong, X. . Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation. , (2005).
- Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).
