Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF
Summary
את הצעדים הדרושים לכוונון ואופטימיזציה יומיים של ביצועים של cytometer המוני CyTOF מתוארים. תגובות על הכנת מדגם אופטימלי וקצב זרימה נדונות
Abstract
בשנים האחרונות, הניתוח המהיר של תאים בודדים יש בדרך כלל בוצע באמצעות cytometry זרימה ונוגדנים שכותרת-fluorescently. עם זאת, סוגיית חפיפת רפאים של פליטות fluorophore הגבילה את מספר הבדיקות בו זמנית. לעומת זאת, cytometer ההמוני CyTOF החדש על ידי זוגות מדעי DVS מערכת הקדמת תא בודד נוזל ICP-MS. 1 במקום fluorophores, פולימרים המכילים איזוטופים chelating מתכת מועשרת-מאוד הם מצמידים לנוגדנים או בדיקות ספציפיות אחרות. 2-5 בגלל טוהר המתכת והרזולוציה המונית של cytometer ההמוני, אין "חפיפת רפאים" מהאיזוטופים שכנים, ולכן אין צורך מטריצות פיצויים. בנוסף, בשל השימוש במתכות lanthanide, אין רקע ביולוגי ולכן אין לה מקבילה של autofluorescence. עם חלון המוני הפורשים מסה אטומית 103-203, באופן תיאורטי עד 100 תוויות יכולות להבחין בו זמנית. כיום, יותר מ 35 ערוצים זמינים באמצעות ריאגנטים chelating הזמינים ממדעי DVS, המאפשר לנתיחת תקדים של הפרופיל החיסוני של דגימות. 6-7
חסרונות cytometry המוני כוללים דרישה המחמירה לאיזוטופ נפרד מתכת לבדיקה (אין מקביל לפיזור קדימה או בצד), ועובדה שמדוברת בטכניקה הרסנית (אין אפשרות למיון החלמה). התצורה הנוכחית של cytometer המסה יש גם שיעור תא שידור של רק ~ 25%, ולכן דורש קלט מספר גבוה יותר של תאים.
ביצועים יומיים אופטימליים של cytometer ההמוני דורשים מספר שלבים. המטרה הבסיסית של אופטימיזציה היא למקסם את עוצמת האות הנמדדת של איזוטופים המתכת הרצויה (M) תוך מזעור ההיווצרות של תחמוצות (16 '), שיהיה הפחתה בעוצמת אות M ולהפריע לאות רצויה בM 16. הצעד הראשון הוא לחמם את המכונה כל כך חם, אני יציבCP פלזמה כבר נקבע. שנית, את ההגדרות עבור קצב זרימת גז נוכחי ואיפור חייבות להיות מותאמות על בסיס יומי. במהלך איסוף דגימה, שיעור אירועי התא המרבי מוגבל על ידי יעילות גלאי ומהירות עיבוד עד 1000 תאים / 2. עם זאת, בהתאם לאיכות המדגם, שיעור אירועי תא איטי יותר (300-500 תאים / 2) הוא בדרך כלל רצוי שיאפשר רזולוציה טובה יותר בין אירועי תאים ובכך למקסם את הגופיות שלמות על כפילויות ופסולות. לבסוף, ניקוי נאות של המכונה בסוף היום מסייע למזער אות רקע בשל מתכת חופשיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במשך העשורים האחרונים, cytometry הזרימה פלואורסצנטי היה סוס עבודת שיטה לניתוח תאים בודדים, הוא במונחים של ביטוי בשטח ומבחנים תפקודיים. עם זאת, בסוגיות של חפיפת ספקטרום של צבעי הניאון הגבילו את מספר הסמנים בו זמנית. בעוד ניסויים באמצעות יותר מ 12 סמנים בו זמנית כבר דיווחו, ס…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד"ר האוון ניואל וד"ר שון Bendall למשוב. אנחנו גם רוצים להודות למדעים וDVS ד"ר שון Bendall למדגם בחרוזי הקלקר בעל מספר lanthanide המכיל. אנו מודים למימון ממענק NIH 2 U19 AI057229.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| CyTOF mass cytometer | DVS Sciences | ||
| Wash solution | DVS Sciences | 201071 | 0.05% hydrofluoric acid in water |
| Tuning solution | DVS Sciences | 201072 | 0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid |
| Eu-containing polystyrene beads | DVS Sciences | 201073 | Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml |
| Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads | DVS Sciences | Not yet commercially-available | Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides |
| Nitric acid (concentrated) | Fisher Scientific | A467-500 | Optima trace-metal pure ICP-MS grade |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml | BD | 352235 | used to filter cell samples before injection |
| Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | silicone-free, latex-free |
| Norm-Ject syringe-3 ml | Henke Sass Wolf | 4010.000V0 | silicone-free, latex-free |
| MilliQ water | 18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present). | ||
| Citranox | Sigma-Aldrich | Z273236 | acid detergent |
| Argon gas | Praxair | AR 5.0UH-T | 99.999% Ultra-high purity |
Referenzen
- Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
- Lou, X. Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays. Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).
- Majonis, D. Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain. Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).
- Leipold, M. D. Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination. Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).
- Bendall, S. C. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Newell, E. W. Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes. Immunity. 36, 142-152 (2012).
