在这里,我们描述了一种独特的战略,创建连续不同的层之间的接口为组织工程的生物相容性,多层矩阵。这种支架可以提供一个理想的可定制的环境来调节细胞行为的各种生物,化学或机械的线索
复杂的组织培养矩阵,其中的生物刺激( 例如,生长因子,抑制剂,或小分子)或矩阵结构的类型和浓度( 例如,组合物中,浓度,或刚度矩阵)随空间,将启用了广泛的调查关于这些变量如何影响细胞的分化,迁移等现象。创建层状矩阵的主要挑战是维持层接口的结构完整性没有单个组件从每个第1层中的扩散。目前的方法来实现这一点包括在光2-3,光刻4,顺序functionalization5,冷冻干燥6,微流体7,或离心分离8,其中有许多需要精密的 仪器和技术技能。其他依靠连续的附件,这可能会导致个别层,9层分层</支持>。
dGMP的克服了这些问题,通过使用惰性密度调节剂,如碘克沙醇,来创建层不同的密度10。由于密度调节剂可以混合使用任何预聚物或生物活性分子,dGMP的允许每个支架的层来进行定制。简单地改变的密度调节剂的浓度可以防止相邻的层的混合,同时它们保持水。随后的单步聚合产生结构连续多层的脚手架,其中每个层具有不同的化学和机械性能。密度调节剂可以容易地除去与无扰动各个层或它们的组成部分的充分漂洗。因此,这种技术是非常适合用于创建各种尺寸,形状和材料的水凝胶。
一种协议,用于制造一个2D – 聚乙二醇(PEG)的凝胶,其中的交替层包括RGDS-350,概述如下。我们使用PEG because它是具有生物相容性和惰性。 RGDS,细胞粘附肽11,是用来演示的生物提示的空间限制,和荧光团共轭的(的Alexa Fluor 350),使我们能够在视觉上区别各种层。此过程可适于其他材料( 例如,胶原蛋白,透明质酸等),并可以扩展到制造三维凝胶与一些修改10。
dGMP的是一个简单的策略,为编制多层凝胶,不依赖于昂贵的仪器。此协议可以使用其他的生物相容的材料,如胶原蛋白和透明质酸创建支架适于。生物活性的小分子物质,例如细胞的粘附促进RGDS肽,可以被拴到聚合物基体,以防止混合层与层之间的线索。蛋白质可被封装在不同的层中,而不需要进行化学缀合,因为他们,根据矩阵上的网目尺寸,是不容易扩散通过水凝胶10。在这里,我们用碘克沙醇(Nycoprep),惰性密度改性剂,已被用于活细胞的应用。也可用于其他密度调节剂,如蔗糖和葡萄糖。不同的稳定时间(T),可以精细调整产生光滑或尖锐的过渡,两层之间的接口(更长的稳定时间为平滑的过渡)<SUP> 10。例如,平滑的过渡之间dGMP的凝胶层,可以用于生成一个连续梯度的研究如趋化的细胞过程的生物提示。
密度调节剂的效果对凝胶刚度为15%aPEGda凝胶在图5中所示;作为PEGDA和碘克沙醇浓度的函数的刚度和孔隙度的一个更完整的表征是目前正在评估。虽然在这个例子中的PEGDA浓度是比较高的,我们观察到60%以上的弹性模量在30%的碘克沙醇凝胶相比,凝胶没有。凝胶刚度的变化可以进行调整,以通过调制的大单体浓度或交联密度。
我们还采用dGMP的技术来创建三维多层采用聚丙烯酰胺凝胶和PEG前体10。变的浓度或预聚物的交联度在允许结构变异支架,它可以被用来研究细胞的行为,如在3D的极性生长和迁移。
综上所述,dGMP的是,可应用于制作2D和3D的从生物相容性材料用于范围广泛的生物医学和基础研究应用各种支架的自适应性的技术。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢支持由美国国立卫生研究院主任的新创新者奖(1DP2 OD006499-01至AA和1DP2 OD006460-01 AJE),和阿卜杜勒阿齐兹国王科技城(加州大学圣地亚哥分校在纳米医学的卓越中心)。我们要感谢杰西卡·穆尔女士为她的手稿上的批评意见。
Reagent or Instrument | Company | Catalogue number |
Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) | Laysan | 120-64 |
Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) | Dajac Labs | 9359 |
Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) | American Peptide | 49-01-4 |
N,N– Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma | D125806 |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2438 |
N,N- dimethylformamide (DMF) | Fisher | D119-4 |
Tetrahydrofuran (THF) | Fisher | T397 |
Dialysis cassette (3500 Da) | Thermo Scientific | 66330 |
Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester | Life Technologies | A-10168 |
Sigmacote | Sigma | SL2 |
Silicone spacers | Grainger | 1MWA4 |
Biopsy punches | Acuderm | P1025 (10 mm) P850 (8 mm) |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Hyclone | SH30028 |
Iodixanol (NycoPrep) | Fisher | NC9388846 |
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life Technologies | 11054 |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 |
Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140 |
C2C12 myoblasts | ATCC | CRL-1772 |
MALDI | Bruker | N/A |
UVR-9000 | Bayco | UVR-9000 |
VersaDoc | Bio-Rad | N/A |