Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em> Plasmodium berghei</em> ANKA-enfekte Fare
Summary
Beyin kan damarlarının gelen yapışık inflamatuar lökositlerin izolasyonu için bir yöntem<em> Plasmodium berghei</em> ANKA ile enfekte olmuş fareler tarif edilmektedir. Yöntemi flow sitometri ile floresan antikorlar ve müteakip analizler ile boyanarak miktarının yanı sıra izole lökositlerin fenotipik karakterizasyonu sağlar.
Abstract
Biz P. beyin kan damarlarından yapışık inflamatuar hücrelerin izolasyonu ve karakterizasyonu için bir yöntem tarif berghei ANKA-enfekte fareler. Deneysel serebral sıtma indüksiyon, bir nörolojik sendromu bu parazitin suşu sonuçlar duyarlı fare suşlarının enfeksiyonu insanlarda 1,2 Plasmodium falciparum aracılı şiddetli sıtma özetlediği bazı önemli yönleri olduğunu. Kan aşama sıtma Olgun formlar vasküler endotel hücreleri ile bağlamak sağlar enfekte eritrosit, yüzeyi üzerinde parazit proteinleri ifade eder. Bu süreç hipoksi ve kanamalar 3 sonuçlanan kan akımında engel indükler ve aynı zamanda parazit sekestrasyon sitesine inflamatuvar lökositlerin işe uyarır.
Diğer enfeksiyonlar, örneğin neutrotopic virüsler 4-6, sıtma-parazitlenmiş kırmızı kan hücreleri (pRBC) yanı sıra ilişkili yatkın aksine, hemekspirayon lökositlerin kan damarları içindeki yerine beyin parankimi infiltre daha münzevi kalır. Böylece non-inflamatuar dolaşan hücre, organ çıkarma ve doku işleme öncesi enfekte-farelerin geniş intracardial perfüzyon ile sekestre lökositlerin kirlenmesini önlemek için kan bölmesi çıkarmak için bu prosedürü gereklidir. Perfüzyon sonra, beyinleri hasat edilir ve küçük parçalar halinde disseke. Dokuların yapısı daha da oluşan beyin homojenat sonra miyelin ve diğer doku enkaz beyin sekestre lökositlerin ayrılması (BSL) sağlayan bir Percoll degrade üzerinde santrifüj edilir Kollajenaz D ve DNAz I. ile enzimatik tedavi ile bozulur. İzole hücreler daha sonra yıkanır, flow sitometri ile sonraki analiz için floresan antikorlar ile hemasitometre ve lekeli kullanılarak sayıldı.
Bu prosedür inflamatuvar lökositlerin kapsamlı fenotipik karakterizasyonu re beyin göç veriyorinme gibi viral veya paraziter enfeksiyonlar gibi çeşitli uyarılara yanıtı. Yöntemi de klinik öncesi hayvan modellerinde yeni anti-inflamatuvar tedaviler değerlendirilmesi için yararlı bir araç sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
BSL izolasyonu ve karakterize edilmesi ve analiz deneysel fare modellerinde doku hasarı ya da enfeksiyona yanıt olarak beyin göç inflamatuar hücrelerin miktarının sağlayan bir yöntem. Organ ekstraksiyonu ve bunu izleyen hücre izolasyonu önce kan bölmesinin çıkarılması için bir intracardial perfüzyon adım giriş non-inflamatuar dolaşımdaki lökositler ile inflamatuar hücrelerin kirlenmesini önlemek için yararlıdır. Bu inflamatuar hücreler beyin parankimi 5 nüfuz hangi tür kemirgen …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar teknik yardım için Bayan Liana Mackiewicz teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Victoria Eyalet Hükümeti Operasyonel Altyapısını Destekleme ve Avustralya Hükümeti Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi IRIISS ve Proje Hibe 1031212 sayesinde mümkün oldu.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa’s azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 |
Referenzen
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
