Muismodellen voor Graft Arteriosclerosis

Summary

We beschrijven protocollen voor onze muis graft arteriosclerois (GA) modellen die tussenkomst van een muis bloedvatsegment betrekken in een ontvanger van dezelfde inteeltstam. Door terugkruisen extra genetische veranderingen in het vat donor kan het model het effect van specifieke genen op GA beoordelen.

Abstract

Graft arteriosclerois (GA), ook wel allogreffevasculopathie is een pathologische laesie die zich ontwikkelt over maanden tot jaren in getransplanteerde organen gekenmerkt door diffuse, perifere stenose van het gehele transplantaat vaatstelsel. De meest kritische component van GA pathogenese is de proliferatie van gladde spier-achtige cellen in de intima. Wanneer een menselijke kransslagader segment wordt geplaatst in de infra-renale aorta van immunodeficiënte muizen, kan de Intimas te breiden in reactie op adoptief overgedragen humane T-cellen allogeen de slagader donor of exogeen humaan IFN-γ in de afwezigheid van menselijke T-cellen. Tussenplaatsing van een muis aorta van een stam naar een andere muis stam ontvanger beperkt als model voor chronische afstoting bij mensen omdat het acute celgemedieerde afstotingsreactie in dit muismodel volledig elimineert alle donor-afgeleide vasculaire cellen van het transplantaat binnen twee tot drie weken. We hebben recent ontwikkelde twee nieuwe mOuse modellen om deze problemen te omzeilen. Het eerste model betreft tussenkomst van een segment schip uit een mannelijke muis in een vrouwelijke ontvanger van dezelfde inteeltstam (C57BL/6J). Transplantaatafstoting in dit geval alleen gericht tegen kleine histocompatibility antigenen gecodeerd door het Y-chromosoom (aanwezig in de mannelijke maar niet de vrouwelijke) en afstotingsreactie die volgt voldoende lui om donor-afgeleide gladde spiercellen behouden gedurende enkele weken. Het tweede model is sprake tussenplaatsing van een slagader segment van een wildtype muis C57BL/6J donor in een gastheer muizen van dezelfde stam en geslacht de receptor mist IFN-γ gevolgd door toediening van muizen-IFN-γ (geleverd door infectie van de muis lever met een adenovirale vector. er geen afstoting in dit geval zowel de donor en ontvangende muizen van dezelfde stam en geslacht maar donor gladde spiercellen prolifereren in reactie op de cytokine terwijl gastheer-afgeleide cellen, ontbreekt receptor voorDit cytokine, niet reageren. Door terugkruisen extra genetische veranderingen in het vat donor kunnen beide modellen worden gebruikt om het effect van specifieke genen op GA progressie beoordelen. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor onze muis GA-modellen.

Introduction

Graft arteriosclerois (GA), ook wel allogreffevasculopathie is een pathologische laesie die zich ontwikkelt over maanden tot jaren in getransplanteerde organen gekenmerkt door diffuse, perifere stenose van het gehele transplantaat vaatstelsel ^7. Vroeg stadium kan veroorzaken excentrieke en focale vernauwingen die zijn meer voor de hand in de slagaders, waardoor meer gelijkenis vertonen met vernauwingen gezien in conventionele atherosclerose. Het lumen verlies van het transplantaat vaartuigen resultaten van intimale uitzetting door infiltratie van gastheer T-cellen en macrofagen en vooral accumulatie van extracellulaire matrix en gladde spier-achtige cellen afkomstig van graft, host of beide ^{5, 13, 19,} die onvoldoende wordt gecompenseerd door uiterlijke schip verbouwen. In cardiale allotransplantaten, de klinisch significante laesies die in de epicardiale en intramyocardiale kransslagaders. Uiteindelijk zal GA van de coronaire arteriën ischemisch hartfalen. GA is de belangrijkste oorzaak van late cardiale graft verlies. De stenose van GA stoppen bij de hechtdraad lijnen, sterk implicating de gastheer respons op graft alloantigenen in de pathogenese en leidt ons naar GA classificeren als een vorm van chronische afstoting ^3. Echter, kunnen andere vormen van arteriële schade het risico van GA verhogen, hetzij door middel van het verhogen van de netto lasten van letsel of door intensivering en / of moduleren van de allo-respons. De endotheelcel (EC) bekleding van graft slagaders bewaard in menselijk GA en de oppervlakkige gebieden van de intima naast de EC voering is de plaats zwaarst geïnfiltreerd door gastheer-afgeleide IFN-γ-producerende T-cellen en macrofagen ^11, in sommige patiënten GA wordt geassocieerd met de ontwikkeling van donor-specifieke alloantistoffen die binden aan graft EC ¹⁶ maar de vaartuigen leveren weinig bewijs van fibrinoïde necrose die karakteristiek acute antilichaam-gemedieerde afstoting ^11.

De meest kritische component van GA pathogenese is deproliferatie van gladde spier-achtige cellen in de intima, of deze taak kan worden aangehouden, GA waarschijnlijk vooruitgang. Eerdere werk van onze groep had aangetoond dat Intimas van menselijke kransslagader segmenten geplaatst in de infra-renale aorta's van immunodeficiënte muizen uit te breiden in reactie op adoptief overgedragen menselijke T-cellen allogene aan de slagader donor en dat dit proces kan worden geremd door het neutraliseren van de menselijke IFN- γ ^18. Verder exogene humane IFN-γ kan intimale veroorzaken (en mediale) vasculaire gladde spiercel (VSMC) proliferatie in deze arteriële grafts in de afwezigheid van menselijke T-cellen ^{15, 17.} (Het is belangrijk op te merken dat de mens en muis IFN-γ niet oversteken species, het uitsluiten van indirecte effecten op de muis gastheer in deze experimentele systeem.) Deze gehumaniseerde muismodellen hebben het voordeel van recapituleren menselijke T-cel / vasculaire cel interacties en de intima laesies zijn grotendeels uit humaan (bijvoorbeeld graft-afgeleide cellen)zoals is waargenomen in klinische monsters, maar zij niet volledig de klinische situatie herhalen omdat ze voorbijgaan aan de rol van gastheer macrofagen en mogelijk andere celtypen betrokken bij klinische transplantatie laesies. Een conventionele muismodel van dit proces kunnen theoretisch probleem aanpakken, als aanvulling op de beperkingen van de gehumaniseerde model door met een compleet gastheerimmuunsysteem en die de extra voordeel dat de kracht van de muis genetische benaderingen worden toegepast GA. De twee meest gebruikte muismodellen betrekken heterotopische harttransplantatie en orthotopische slagader transplantatie ^1. De letsels die zich ontwikkelen in de slagaders van heterotopische hart enten zijn grotendeels opgebouwd uit gastheercellen, waarschijnlijk van beenmerg herkomst, terwijl intima cellen van de bloedvaten in het menselijke hart enten zijn overwegend van graft oorsprong ^{5, 13, 19.} Dit is een belangrijk onderscheid dat ons ertoe alternatieve muismodellen ontwikkelen. Tussenplaatsing vaneen muis aorta van een stam naar een andere muis stam ontvanger nog beperkter als een model voor chronische afstoting bij mensen omdat het acute celgemedieerde afstotingsreactie in dit muismodel volledig elimineert alle donor-afgeleide vasculaire cellen van het transplantaat binnen twee tot drie ¹⁹ weken. Bijgevolg is de volgende veranderingen gezien in de tussengelegen segment vaartuig zijn slechts een antwoord van gastheercellen die de ontcelde vaartuig scaffold zijn herbevolkt, waardoor een sterk artefact situatie van beperkt belang als een model voor de veranderingen in graft vaten die zich in de kliniek. We hebben recent ontwikkelde twee nieuwe muismodellen om deze problemen te omzeilen ^21. Het eerste model betreft tussenkomst van een segment schip uit een mannelijke muis in een vrouwelijke ontvanger van dezelfde inteeltstam (C57BL/6J). Het tweede model gaat invoegen van een slagader segment van een wild-type C57BL/6J muis donor in een gastheer muis van dezelfde stam en het geslacht dat de rec ontbreekteptor voor IFN-γ (IFN-γR-KO) gevolgd door toediening van muizen-IFN-γ (geleverd door infectie van de muizenlever met een adenovirale vector. We beschrijven hier gedetailleerde protocols en voordelen van onze muis GA modellen.

Protocol

Muis transplantaat en syngeen graft transplantatiemodel Alle dierproeven werden goedgekeurd door de institutionele dieren verzorging en commissies gebruik van Yale University. Voor allotransplantaat model, werden segmenten van thoracale aorta van mannelijke, 4-5 weken oude WT (C57BL/6J) of IFN-γR-KO muizen geplaatst in de abdominale aorta van de vrouwelijke ontvanger, 8-12 weken oude WT met een end-to -end microchirurgische anastomose techniek (zie volgende voor details). Voor syngeen graft-mo…

Representative Results

Muis allograft arteriosclerose (GA) model: In dit model wordt een mannelijke donor aorta getransplanteerd in vrouwelijke ontvangende zodat de gastheer induceert alloreactieve T-cel-gemedieerde respons tegen een allo minor Y antigen (het mannelijk-specifieke minor histocompatibility antigen HY) uitgedrukt het transplantaat 12, en op zijn beurt T-cel-geproduceerde IFN-γ drives proliferatie van VSMC 20 zoals waargenomen in andere harttransplantatie modellen 2, 6, 8-10, 14….

Discussion

De beschreven protocollen zijn gericht op de muis GA-modellen. De procedures kunnen worden toegepast op andere graft transplantatiemodellen. Deze modellen omvatten gehumaniseerd xenograft (dwz menselijke kransslagader segmenten geplaatst in de infra-renale aorta's van immunodeficiënte muizen) en acute afstoting muis GA-model (dat wil zeggen een muis aorta van het ene genetische zeef in een andere genetische ontvangende stam). Onze beschreven muismodellen zijn meer voor de menselijke GA letsels slu…

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664	Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks)
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053	Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution	Lloyd Inc.	NADA# 139-236	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml)
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml)
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400	Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml)
Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride)	CareFusion	AL4109
0.9% Sodium Chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10	To prepare the anesthetic
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Microscope	Leica	MZ95
Micro Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5693
Spring Scissors	F.S.T	15009-08	To transect the aorta of donor or recipient
Extra Narrow Scissors	F.S.T	14088-10
Needle Holder/Forceps	MICRINS	MI1542	To hold the needle
Fine Forceps	F.S.T	11254-20
Forceps	F.S.T	11251-35
Standard Pattern Forceps	F.S.T	11000-12
Forceps	F.S.T	13011-12
LANCASTER Eye Speculum	Zepf Medical Instruments	42-1209-07
Micro Vascular Clip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6472
Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5440
Black Polyamide Monofilament Suture	AROSurgical Instruments Corporation	Cat #T4A10Q07	10-0 suture, Needle=70 microns
Black Monofilament Nylon Suture	Syneture (Covidien)	SN-1956	6-0 suture
Non-Woven Songes	McKesson Corp.	Reorder No. 94442000
1 ml Syringe	BD	REF 309659
3 ml Syringe	BD	REF 309657
10 ml Syringe	BD	REF 309604
18G 1 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305196
25G 7/8, Hypodermic Needle	BD	REF 305124
27G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305109
30G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305106
Hearting Pad	Sunbeam	Z-1228-001
Trimmer	Wahl	9854-500
			Table 2. Specific reagents and equipment.