Una plataforma de detección de luciferasa basado multiplexado para interrogar cáncer asociado transducción de señales en las células cultivadas
Summary
El logro de un nivel de comprensión de los sistemas de procesos celulares es un objetivo de la biología celular moderna. Se describe aquí estrategias para luciferase reporteros multiplexación de varias funciones celulares puntos finales para interrogar la función de genes utilizando RNAi bibliotecas escala del genoma.
Abstract
Interrogatorio escala del genoma de la función génica mediante RNA de interferencia (RNAi) es muy prometedora para la rápida identificación de las vulnerabilidades de células de cáncer químicamente manejables. Limitar el potencial de esta tecnología es la incapacidad para delinear rápidamente la base mecánica de los resultados fenotípicos y por lo tanto informar sobre el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidos molecularmente. Resumimos aquí los métodos de deconstruir fenotipos celulares inducidos por genes RNAi mediada por la orientación utilizando sistemas indicadores multiplexados que permiten el seguimiento del cáncer de los procesos clave asociados a células. Esta metodología de cribado de alto contenido es versátil y se puede adaptar fácilmente para la detección de otros tipos de bibliotecas moleculares grandes.
Introduction
Una variedad de los reporteros de luciferasa basados para el seguimiento de una gran variedad de procesos biológicos celulares están disponibles comercialmente. La mayoría de estas construcciones de ADN que codifican proteínas de luciferasa que son inducidas a expresar por estímulos o perturbaciones celulares específicos. Los reporteros transcripcionalmente basados en la mayoría de los sólidos colocan la expresión de una enzima luciferasa bajo el control de elementos potenciadores sintéticos o regiones promotoras de genes bien establecidos para su fiabilidad en informar de un evento de 1,2 transcripcional fisiológicamente relevante. También hay sistemas de trans-reportero de luciferasa que utilizan GAL4-UAS para conducir expresión de la proteína luciferasa. Gal4 es un activador transcripcional de levadura y la UAS es un potenciador de Gal4 que se une específicamente a activar la transcripción de secuencias de genes situados corriente abajo de la misma 3. Estos tipos de sistemas de luciferasa están típicamente soportadas por dos plásmidos de ADN – uno codifica la proteína GAL4 fusionado a la REGULATORY porción de una proteína de interés, y el segundo codifica una proteína luciferasa colocado bajo el control de una o más secuencias UAS. Por lo tanto, la señal de luciferasa celular refleja el nivel de actividad de la proteína de interés. Otro uso común de los reporteros de luciferasa basados es para el seguimiento de la estabilidad de proteínas mediante el cual una proteína de interés se fusiona con una enzima luciferasa 4. Sin importar el tipo de reportero, un caveat emptor se observa aquí no se puede asumir la especificidad de cualquier periodista que ha sido así interrogado. Por lo tanto, se requiere la debida diligencia en la incorporación de nuevas construcciones reportero en cualquier estrategia de investigación.
La selección de la enzima luciferasa de lectura puede ser tan importante como la fiabilidad de los elementos de ADN que controlan su expresión. Considerando que la luciferasa de luciérnaga (FL) es la enzima más comúnmente utilizado en construcciones disponibles comercialmente, la llegada de nuevos sistemas de informadores de luciferasa que no requieren ATP (como en el casode reacciones FL-based) o que incorporan enzimas más estables que emiten señales más fuertes promesa de mejorar la eficiencia y la fiabilidad de esta plataforma de investigación. Una nota importante sobre la selección de los reporteros de luciferasa en los estudios químicos es la susceptibilidad de FL a la inhibición química que podría dar lugar a informes falsos. En nuestra experiencia, otras enzimas tales como la luciferasa de Renilla o Gaussia (RL y GL, respectivamente) que utilizan coelenterazina como sustrato son menos fácilmente inhibida por moléculas pequeñas 5.
El formato más común para la multiplexación de luciferasa lecturas del implica el uso de FL y RL en gran medida dada la disponibilidad de fácil de utilizar con los kits de la capacidad de medir secuencialmente las actividades enzimáticas a partir de una sola muestra. En la mayoría de los kits, las muestras se expusieron primero a luciferina para revelar los niveles de actividad FL seguido de un reactivo de extinción que se depositan simultáneamente con coelenterazina para producir una segundaseñal RL dary. Con la adición de otras luciferasas que pueden ser secretadas tales como GL o que el uso de otro sustrato tal como Cypridina luciferasa (CL), un mayor número de posibilidades para la generación de datos de alta contenido utilizando luciferasas han surgido. Un ejemplo de un genoma de gran pantalla de RNAi mediante esta técnica se puede encontrar aquí 6. Estos avances tecnológicos tienen a su vez estimulado el desarrollo de mecanismos específicos para saciar cada tipo de enzima luciferasa para limitar la diafonía 7. En nuestras manos, observamos una mayor frecuencia de "efectos de borde" inexplicables (tendencias en la actividad celular asociada con el borde de las placas de cultivo de alto título), con luciferasas secretadas tales como GL o CL. Por otra parte, tales luciferasas secretadas son útiles para ensayos cinéticos, ya que permiten muestreo de la señal sin adulterar la viabilidad celular.
Para nuestro estudio presentado aquí, vamos a monitorear simultáneamente la actividad de tres cáncer relevanteprocesos celulares: el p53, Kras y Wnt vías de transducción de señales. Los periodistas incorporados en nuestro estudio son el FL reportero pp53-TA-Luc de Clontech (en adelante, el periodista p53-FL) 8, un sistema reportero Elk1-GAL4/UAS-CL (en adelante, Elk-1 reportero; Agilent), y el reportero de 8X TCF RL que incorpora múltiples elementos potenciadores sintéticos reconocidos por la vía Wnt reguladores transcripcionales conocidos como factores de células T (o TCF) 9-11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios proveedores de sistemas de reportero luciferasa basados (tales como Promega, sistemas de focalización, New England Biolabs, y Thermo Fisher) que proporcionan útiles recursos en línea para aquellos que entretener una pantalla de alto rendimiento para la primera vez. Además, un número de excelentes críticas con respecto a la optimización de la utilización de pantallas de alto rendimiento para el descubrimiento de genes y cómo RNAi basada en los resultados de detección pueden estar integrados con…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos el apoyo financiero de CPRIT (RP100119) y la Fundación Welch (I-1665).
Materials
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
| Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen Inc. | 301427 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferase Assay reagent | Targeting Systems | VLAR-1 | |
| HCT116 cells | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Model 832 | |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Reichert Hemacytometers | Hausser Scientific Company | 1490 |
Referenzen
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