저널을 사용하여 인간의 망막 수술 표본의 Transcriptomic 분석
Summary
우리는 망막 박리의 transcriptomic 분석 retinectomy에서 망막 샘플을 사용했습니다. 우리는 수술 블록과 실험 사이의 RNA 절약 할 수있는 절차를 개발했다. 우리는 정제 된 RNA를이 마이크로 어레이 분석에 적합하다는 것을 보장하기 위해 세슘 염화물 원심하여 RNA를 정화하는 표준 프로토콜입니다.
Abstract
망막 박리 (RD)은 망막 색소 상피 (RPE)에서 감각 신경 망막의 분리를 설명합니다. RPE는 빛에 민감한 뉴런, 광 수용체의 정상적인 기능에 필수적입니다. RPE에서 망막 박리 세포 외액으로 가득 물리적 차이를 만듭니다. RD는 감각 신경 망막 이온과 대사 산물의 생리적 교환이 심각하게 교란되기 때문에 RPE 모두에 영향을 세포 및 분자 불리한 이벤트를 시작합니다. 비전에 대한 결과는 비전 1의 복원의 두 조직 결과의 신속한 reapposition 이후 박리의 기간에 관련되어 있습니다. RD의 치료는 단독으로 수술이다. 유리체 겔 (유리체 절제술)의 제거는 망막 박리를 선호하는 분리 된 주변 망막의 제거에 필수적이지 않은 부분옵니다. 제거 된 망막 표본은 고해상도 nullius (1 개)이며, 따라서 일반적으로 버려.이러한 수술 표본에서 RNA를 복구하려면, 우리는 실험실 수술 블록 전송하는 동안 RNA 보존 할 수있는 절차 일기를 개발했다. 우리는 또한 세슘 염화물 원심하여 RNA를 정화하는 표준 프로토콜은 정제 된 RNA를 글로벌 유전자 발현 분석에 적합하다는 것을 보증한다. RNA의 품질은 모두 RT-PCR과 마이크로 어레이 분석에 의해 확인되었다. 데이터의 분석은 RD 동안 염증과 시세포 변성의 동시 참여를 보여줍니다.
Introduction
망막 박리의 주요 치료 목표 (RD)은 망막 색소 상피 세포에서 광 수용체의 분리로 인한 광 수용체 세포의 손상과 망막 염증을 제한하는 방법을 찾을 수 있습니다. RD 동안 RPE 세포는 dedifferentiate, 마이그레이션, 활성화되고, 합병증으로 이어지는 수축 힘을 발휘, 분리 된 망막의 표면에 확산. RD의 전사 체학 분석 RD 수술과 함께있는 최종 시력 예후를 향상시킬 수 있습니다 따라서 향후 치료 분자에 따라 수정 된 표정으로 표적 유전자를 확인하는 방법입니다. 그것은 잘 디옥시리보 핵산 (DNA)이 그대로 리보 핵산 (RNA)이 안정되지 알려진 유전 연구에 광범위하게 사용되는 후자의 안정성은 2 세 이상의 30,000 년 생물학적 샘플에서 네안데르탈 인 게놈의 시퀀싱을 허용했다. 메신저 RNA에 게놈에서 유전자의 DNA의 전사입니다주요 유전자 발현 과정 및 발현는 신호를 구성하기 위해 불안정한입니다. RNA를이 신호를 종료 RNase의 효소에 의해 매우 빠르게 분해합니다. 식을 연구 실험실에서 연구되기 전에 조직이 유기체에서 고립되면, RNA를 매우 자주 저하됩니다. 성능이 저하 된 RNA 분석을 유전자 발현에 적합하지 않습니다. 실험실 직원이 수술에 참여할 수 없기 때문에, 우리는 쉬운 절차를 개발하고 만 의사가 적절한 RNase가없는 솔루션으로 조직을 복구해야합니다. 조직의 RNA가 안정이 솔루션 실온에서 72 시간 후 분해의 부호없이 분석 할 수 있습니다. 시료에서 RNA를가 실험실 3에 전송 된 후 세슘 클로라이드 그라디언트 원심을 포함하는 표준화 된 방법에 의해 정제된다. 다음의 RNA 품질 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 및 RT-PCR에 의해 평가된다. RNA 정화 프로토콜을 가지고DNA와 RNA에 따라 다릅니다 및 RNA는 유전자 발현 연구에서 인공적인 신호를 생성하는 DNA 분자에 의해 오염되지 않도록 보장 그 밀도에 따라 분자를 분리 장점. 또한, 정량적으로 세포 내에서 가장 풍부한 RNA있는 전송 RNA를 (tRNAs를가), 리보솜 RNA (rRNAs)와 메신저 RNAs (mRNA가)되고 두 최근에서 같은 물리적 특성에 따라 분리 정제 공정의 제품을 끝낸다. 마이크로 어레이 분석 프로토콜의 대부분은 tRNA의 4-6 저해하는 역전사와 RNA 중합 효소의 사용을 포함 이후 준비에서의 tRNA의 제거에 유용합니다. 수술 표본에서 정제 된 RNA는 표준 프로토콜을 사용하여 레이블 및 마이크로 어레이 칩을 교배 그 결과는 두 개의 보완적인 방법으로, 거짓 발견 속도 방법을 사용하여 상호 정보 visuali에 따라 새로운 방법을 사용하여 분석하는웹 기반 서버 Retinobase 7,8에 데이빗.
Protocol
Representative Results
Discussion
수술 블록의 조직 복구를위한 절차의 개발은 망막 박리의 사체 분석에 필수적이다. 하나는 수술이 유형의 비상 사태와 안과 운영들이 조작 할 때 생물학 연구 프로그램에 참여하려면 약간의 시간을 가지고 연습을 통지해야한다. 이 retinectomy는 통계 수치에 도달하는 쉬운 방법은 네트워크에서 작동하는 것입니다, 그래서 각 서비스에 확률 론적으로 수행됩니다. 이러한 네트워크, 조직 컬렉션의 표…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 RNA 정화 프로토콜을 편집 그들의 도움을 사챠 Reichman 도미니크 Santiard – 남작 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Power supply | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Supplied with PT-DA 2105:2 |
| Agarose gel electrophoresis device | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml sterile polyethylene tube | Greiner | 115261 | |
| Sterile polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Chemical reagents | Sigma | Molecular biology grade (RNase and DNase free products) | |
| Cleaning Solution | VWR | RBS | |
| Microarray chip | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
Referenzen
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