Summary
Vi beskriver en fremgangsmåde til at skabe en pålidelig model for cerebral venøs hypertension i den voksne mus. Denne model er blevet bredt beskrevet og testet i rotter. Denne nye modpart i mus åbner mulighed for at anvende genetiske modificerede dyr og derved udvider anvendelser af modellen.
Abstract
Forståelsen af patofysiologi hjernen arteriovenøse misdannelser og arteriovenøse fistler har forbedret takket være dyremodeller. En rottemodel skabe en kunstig fistel mellem den fælles carotidarterie (CCA) og den eksterne halsvene (ejv) er blevet bredt beskrevet og viste sig at være teknisk muligt. Denne konstruktion fremprovokerer en konsistent cerebral venøs hypertension (CVH), og derfor har hjulpet studere bidraget af venøs hypertension dannelse, kliniske symptomer og prognosen for hjernen AVM'erne og durale AVFs. Ækvivalente musemodeller er kun næppe beskrevet og har vist problemer med stenose af fistula. En etableret murin model ville tillade undersøgelse af ikke blot patofysiologi men også potentielle genetiske terapier for disse cerebrovaskulære sygdomme.
Vi præsenterer en model af arteriovenøs fistel, der producerer en holdbar intrakraniel venøs hypertension i mus. Microsurgical anastomose of murine CCA og ejv kan være vanskelig på grund diminutive anatomi og ofte resulterer i en ikke-patent fistel. I dette trin-for-trin-protokol vi fat på alle de vigtige udfordringer opstod under denne procedure. Undgå overdreven tilbagetrækning af venen under eksponeringen, hjælp 11-0 suturer i stedet for 10-0, og gøre en nøje planlagt ende-til-side anastomose er nogle af de kritiske trin. Selv om denne metode kræver avancerede mikrokirurgiske færdigheder og en længere indlæringskurve, at tilsvarende i rotter, det konsekvent kan udvikles.
Denne roman model er designet til at integrere transgene mus teknikker med en tidligere veletableret eksperimentelt system, der har vist sig at være nyttigt at studere hjernen AVM'erne og Dural AVFs. Ved at åbne mulighed for at anvende transgene mus, kan et bredere spektrum af gyldige modeller opnås og genetiske behandlinger kan også testes. Den eksperimentelle konstruktion kunne også tilpasses yderligere til studiet af othendes cerebrovaskulære sygdomme med venøs hypertension, såsom migræne, forbigående global amnesi, forbigående monokulære blindhed, etc.
Introduction
Dyremodeller for cerebral venøs hypertension har vist sig at være et vigtigt redskab i forståelsen af patofysiologien af hjernen arteriovenøse misdannelser og arteriovenøse fistler 1-7. Den mest udbredte er rottemodellen skabt gennem en kunstig fistel mellem den fælles carotidarterie (CCA) og den eksterne halsvene (ejv), som fremkalder en konsistent cerebral venøs hypertension (CVH) i rotten 1,8-10. Ækvivalente musemodeller, ved at åbne mulighed for at anvende forskellige transgene mus stammer, vil tillade yderligere undersøgelse af ikke blot patofysiologi men også potentielle genetiske terapier for disse cerebrovaskulære sygdomme. Endvidere eksperimentelle konstruktion kunne også tilpasses yderligere til studiet af andre cerebrovaskulære sygdomme med venøs hypertension, såsom migræne, forbigående global amnesi, forbigående monokulære blindhed, etc. 11 imidlertid tidligere forsøg på at konstruere disse musemodeller have vist vanskelighederne med åbenheden af fistel på grund af den diminutive anatomi 5,12. Her beskriver vi vores trin-for-trin-protokollen for en vellykket anastomose af murine CCA og ejv der udmønter sig i en langsigtet patent fistel og en varig venøs hypertension i musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af Mouse
- Fremkald generel anæstesi i mus med isofluran gas. Injicer 0,15 ml intraperitoneal brupenorphine for smertebehandling. Før du fortsætter, skal du kontrollere, om anæstesien er tilfredsstillende ved at prikke musens poter.
- Sæt musen liggende på ryggen med de fire lemmer fastsat af tape. Fjerne hår af halsen og det øvre bryst med en saks. Via subkutan injektion, administrere 0,2-0,4 ml 0,9% saltvand for at holde musen hydreret under den kirurgiske procedure.
- Forbered operative felt efter en streng steril metode. Det område af huden indsnit skal rengøres med 90% alkohol.
2. dissekere carotis arterie og den eksterne halsvene
- Foretag en horisontal midterlinje cervikal incision over det nedre halsområdet af musen. Efter uddybe såret, ophøje spytkirtlerne og livmoderhalskræft blødt væv ved hjælp af på-fraktion sutur (figur 1). Expose den rigtige eksterne halsvene (ejv) lateral til musculus sternocleidomastoideus (SCM). Dette trin skal udføres under lup, da overdreven trækkraft over venen kan beskadige den og fremkalde dens trombose.
- Dissekere forsigtigt den rigtige ejv langs sin kurs fra kravebenet til kraniet base. Normalt elektriske bipolære pincet, koagulerer, og dele alle grene til at udarbejde en passende længde til senere midlertidige klip placering og anastomose.
- Lateral til luftrøret og mediale til SCM, udforske fælles halspulsåren (CCA). Det bør omhyggeligt eksponeres fra kravebenet til lige over sin tvedeling i de eksterne og interne halspulsårer. Under dette trin, bør man være opmærksom igen for at undgå overdreven trækkraft til ejv der senere kan kompromittere åbenheden af anastomose.
3. Forberedelse af anastomose
- Ligere CCA med 10-0 Nylon lige proksimalt for sin bifurkation. Dernæst anvendes en midlertidig klippet over den proximale CCA så tæt på kravebenet som muligt.
- Når strømmen er afbrudt, transektere arterien lige under forgreningen ligatur og overrisle det med saltvand at udvaske resterende blod inde i lumen. Undgå bipolar koagulation i dette trin, da termisk skade på arterievæggen kunne sætte den fremtidige anastomose i fare.
- For at forbedre synligheden af kanterne af ejv er den mediale væg markeret med en blå markering pen langs løbet af den planlagte venotomi. Når ejv er markeret, skal du bruge en 10-0 sutur at ligere den distale ende som caudale som muligt og anvende en midlertidig vaskulær klip på den proksimale ende som kraniel som muligt.
- Med en fin 30 G nål og 0,5 ml sprøjte, foretage en indledende åbning på det markerede område af ejv og straks overrisle lumen med saltvand for at undgå trombedannelse. Dernæst udvide venotomi med microscissorsindtil længden er omkring 2-3 gange diameteren af CCA. Undgå voldsom udspænding og være opmærksom på at holde et skarpt og pæn forkant.
- Omtrentlig slutningen af CCA til ejv. Lav en side-skåret snit i donor ende af CCA at justere diameteren til længden til venotomi størrelse (figur 2).
4. End-to-side anastomose
- Brug en 11-0 monofilament nylon sutur for CCA-til-ejv ende-til-side anastomose. Suturering mediale væg af anastomose i en craneo-caudal retning er det indledende trin. Hver søm skal placeres udefra-i venøse væg først (figur 3) og indefra-ud arterievæggen (figur 4) ved siden af. Dette vil holde knude på ydersiden af det anastomotiske fartøjer på alle tidspunkter (figur 5). Enten afbrudt eller kontinuerlige suturer kan anvendes, men alle kontinuerlige suturer bør strammes som det sidste trin.
- Once den mediale væg er blevet syet, skal du gentage proceduren fra caudale til craniale med den laterale væg. Nu hver sting skal placeres udefra-i arterievæggen først og inside-out fra den venøse væggen ved siden. Saline kunstvanding vil hjælpe med at holde lumen anastomosen synlig på alle tidspunkter i løbet af proceduren.
- Efter efterbehandling alle trin i anastomosen, fjernes den midlertidige klip fra venen først og fra arterien næste. Den arterielle blod vil strømme ind i ejv med ingen eller ringe oser fra anastomose (se videoer VH model og VH-model 2). Den minimale blødning bør stoppe uden brug af bomuld kompression over anastomose. Dette skal undgås for at forhindre thrombose af den fine vene.
- Når pulserende strømme gennem anastomosen er bekræftet, og der observeres ingen tilsyneladende blødning, overrisle det kirurgiske område med saltvand og lukke cervikal incision med en 6-0 nylonsutur. Endelig administrere 0,15 ml mere intraperitoneal brupenorphine for postoperativ smertelindring og 0,2-0,4 ml subkutan 0,9% saltvand til at genopbygge enhver blodtab under operationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et vellykket resultat af modellen er et patent arteriovenøs fistel der inducerer venøs hypertension i murine hjerne. For at validere modellen vi oprindeligt målte intrakranielle venetryk i sagital sinus af musene ved 2, 3 og 4 uger efter operationen. 6 forskellige mus blev tildelt hver gang gruppen. Den sinus presset var 8,8 ± 1,2 mmHg i gruppen målt to uger efter operationen. I de 6 mus målt 3 uger efter kirurgi, sinus tryk var 4,7 ± 1,4 mmHg. Endelig målte 6-mus 4 uger efter operation havde en sinus tryk på 3,9 ± 0,6 mmHg (figur 6). Postoperativ to uger sinus tryk var betydeligt højere end sinus tryk ved 3 og 4 uger (begge p <0,001).
Men den komplekse teknik kræves for at måle sinus tryk er ikke nødvendigt at sikre fistel åbenhed og venøs hypertension på en regelmæssig basis. I stedet kan det ønskede resultat være checked ved direkte inspektion af fistel og af kliniske tegn på venøs hypertension i mus.
Åbenheden af fistel direkte kan inspiceres ved afslutningen af den kirurgiske procedure ved to metoder. Den første består af midlertidig obstruerer ejv kranie til anastomsis område med en juveler pincet. Dette punkt er nu den eneste udstrømning af blodet kommer fra CCA. Hvis ende-til-side anastomose er patent, vil distensible ejv straks ballon som vist i åbenheden test video 1. Den anden metode udføres ved at okkludere venegraft distalt for anastomosen og langsomt tømme den, eller "malkning" det med et par guldsmedens tang. Som vist på den anden video til åbenhed test, når okklusionen er frigivet, et patent anastomose bør hurtigt genopfylde tømte segment.
Hvis modellen fungerer, bør udvidelsen af muse øjet bemærkes 24 timer efter operationen. Dette may skyldes består venøs dræning af hoved og hals. Selv om begge øjne bliver udvidet efter operationen, at fænomenet er mere fremtrædende på den opererede side, som kan observeres i figur 7.
Figur 1:. Hudincision En vandret midterlinje cervikal incision over det nedre halsområdet af mus og en blød trækkraft i spytkirtlerne udsætter den højre eksterne halsvene (ejv). Bemærk den overfladiske placering af ejv som berettiger en omhyggelig hudincision at forhindre eventuelle skader på sarte vene.
Figur 2:. Forberedelse af anastomose Den mediale væg ejv er markeret med en blå streg langs løbet af den planlagte venotomi. En side-cut incisionen i donor ende af CCA udføres for at justere diameteren af arterien til længden til venotomi.
Figur 3:. Udenfor-i Den mediale væg anastomose bliver syet i en craneo-caudale retning med 11-0 søm først bragt udefra-i venøse væggen.
Figur 4:. Inside-nålen drives her fra inside-out arterievæggen for at fuldføre en sutur i den mediale væg i passende måde at holde knude på ydersiden af anastomosen.
Figur 5: Hold knude udenfor Note ho.w knude af den afbrudte sutur valgt i dette tilfælde forbliver uden for lumen af fartøjerne for at undgå trombedannelse, der ville okkludere fistel.
Figur 6:. Sinus tryk analyse Denne bart diagram viser grafisk forskellen i intrakranielle sinus målte tryk i mmHg ved 2, 3 og 4 uger efter operationen.
Figur 7:. Exophthalmus En dag efter operationen, begge øjne er forstørret, men det højre øje udvidelsen (ipsilateral til kirurgi) er mere fremtrædende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vedvarende cerebral venøs hypertension er blevet tæt forbundet med mere alvorlige kliniske manifestationer og dårlig prognose hos patienter med durale AVFs og hjerne AVM'erne 3. Disse virkninger af CVH er ofte blevet undersøgt i rottemodeller 1,2,8. En tilsvarende model i mus ville tillade anvendelse af genetisk modificerede dyr, som i sidste ende ville tillade analyse af molekylære veje, der er involveret i patogenesen af venøs hypertension og dets forhold til dura AVF og hjerne AVM.
Her rapporterer vi en metode til at skabe cerebral venøs hypertension i den voksne mus gennem en end-to-side carotis-jugular fistel. Denne nye model forbedrer velbeskrevne carotis-jugular fistler modeller i rotter ved at oversætte det til musen og hvorved den førnævnte mulighed for at undersøge molekylære veje og genterapier.
Almindelige problemer og forslag
En anden almindelig problemstillingen beskadige venen med overdreven trækkraft, komprimering eller dissektion langs sin bane. Derfor skal ejv eksponering omhyggeligt udføres under mikroskop for at identificere en passende plan dissektion. Alle de små grene, der er afstrømning til den bør ligeledes fastlægges og koaguleret. Dette vil undgå ukontrolleret blødning, der kræver komprimering af venen og vil give tilstrækkelig redundans til at undgå overdreven spænding.
Det er ikke ualmindeligt at have dårlig funktion af fistel efter fjernelse af midlertidige klip. I dette tilfælde bør det første skridt være kigge efter mulige punkter af spænding eller vinkling i CCA. Yderligere dissektion af arterien eller delvis resektion af musculus sternocleidomastoideus vil løse dette problem. Men hvis dårlig funktion fortsætter efter disse manøvrer, trombose af anastomose stedet skal mistanke. I så fald i stedet for at genåbne anastomose stedet og fjerne trombe, anbefaler vi at udføre en nyanastomose craniale til den foregående. Det er vores erfaring, en tredje anastomose er umulig. Der er ikke tilstrækkelig længde ejv og musen tåler ikke anæstesi i så lang tid.
Begrænsninger af teknikken
De vigtigste begrænsninger ved denne teknik omfatter: (1) den diminutive anatomi af skibene kræver avancerede mikrokirurgiske færdigheder og en længere indlæringskurve end for den tilsvarende model i rotter; (2) åbenheden af anastomosen ofte kompromitteret af thrombedannelse og længden af muse ejv vil kun tillade en ekstra forsøg på at løse dette problem; og (3) operation kan tage op til tre timer, udsætter musen til en lang anæstesi periode. Men efter foreslået de tekniske forslag over og holde musen varm og hydreret under proceduren, kan et patent CCA-til-ejv skal gennemføres, og en høj overlevelsesprocent af dyrene, der er opnået i vores erfaringer.
En pålidelig og holdbar cerebral venøs hypertension model i mus er et vigtigt redskab, der kan tjene en bred række formål i cerebrovaskulær forskning 13-16. Ved at tilføje knockout-teknologi af transgene mus, bør denne nye model lette yderligere gen-relaterede in vivo forskning for alle de patologier, der er forbundet med cerebral venøs hypertension.
Tidligere har andre forfattere beskrev den venøse hypertension model i rotter og har brugt den til at studere patofysiologien af dural AVF og hjerne AVM 4,5,8,9. Vi har nu beskrive den metode, at kunne oversætte denne samme model til musene, derfor åbne sine anvendelsesmuligheder til alle former for genetisk behandling testning.
Konklusion
Vi viser her en protokol for at opnå et patent CCA-til-ejv anastomose i den voksne mus. Denne fistel giveren holdbar hjerne venøs hypertension, der har været et nyttigt redskab til at udvikle forskellige cerebrovaskulær sygdom modeller hos rotter. Ved at give dette første skridt til at udvikle de samme modeller i musene, åbner vi mulighed for at teste genetiske behandlinger for disse cerebrovaskulære sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De eksperimentelle procedurer med laboratoriedyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of California, San Francisco (UCSF).
Forfatterne har ingen potentielle interessekonflikter i forbindelse med de stoffer og materialer, der anvendes i denne procedure.
Acknowledgments
Projektet er delvist støttet af NIH T32 GM008440 til Espen Walker, R01 NS27713 til William L.Young, P01 NS44155 til William L.Young og Hua Su, R21 NS070153 til Hua SU og af American Heart Association AHA 10GRNT3130004 til Hua Su. Dr. Ana Rodríguez-Hernández støttes af en bevilling fra "Obra Social La Caixa"
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Sterile Microsuture | Arosurgical Ic. | VT5A010Q10 | |
| 11-0 Sterile Microsuture | Arosurgical Ic | VT4A00N07 | |
| DUROTIP Scissors | Aesculap | BC210R | |
| Micro-Adson Tissue Forceps | Aesculap | BD510R | |
| Microscissors | Aesculap | OC496R | |
| Micro Forceps #5 Jewelers | Aesculap | BD331R | |
| Angled Jewelers Forceps | Aesculap | BD329R | |
| Micro Suture Forceps | Aesculap | BD338R | |
| DUROGRIP Needle Holder | Aesculap | BM009R |
References
- Bederson, J. B., Wiestler, O. D., Brüstle, O., Roth, P., Frick, R., Yaşargil, M. G. Intracranial venous hypertension and the effects of venous outflow obstruction in a rat model of arteriovenous fistula. Neurosurgery. 29, 341-350 (1991).
- Gao, P., Zhu, Y., Ling, F., Shen, F., Lee, B., Gabriel, R. A., Hao, Q., Yang, G. Y., Su, H., Young, W. L. Nonischemic cerebral venous hypertension promotes a pro-angiogenic stage through HIF-1 downstream genes and leukocyte-derived MMP-9. J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1482-1490 (2009).
- Kim, H., Su, H., Weinsheimer, S., Pawlikowska, L., Brain Young, W. L. arteriovenous malformation pathogenesis: a response-to-injury paradigm. Acta Neurochir. Suppl. 111, 83-92 (2011).
- Lawton, M. T., Arnold, C. M., Kim, Y. J., Bogarin, E. A., Stewart, C. L., Wulfstat, A. A., Derugin, N., Deen, D., Young, W. L. Radiation arteriopathy in the transgenic arteriovenous fistula model. Neurosurgery. 62, 1129-1138 (2008).
- Lawton, M. T., Stewart, C. L., Wulfstat, A. A., Derugin, N., Hashimoto, T., Young, W. L. The transgenic arteriovenous fistula in the rat: an experimental model of gene therapy for brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 54, 1463-1471 (2004).
- Schaller, B., Graf, R., Sanada, Y., Tolnay, M., Rosner, G., Wienhard, K., Heiss, W., D, Hemodynamic changes after occlusion of the posterior superior sagittal sinus: an experimental PET study in cats. AJNR Am J Neuroradiol. 24, 1876-1880 (2003).
- Zhu, Y., Lawton, M. T., Du, R., Shwe, Y., Chen, Y., Shen, F., Young, W. L., Yang, G. Y. Expression of hypoxia-inducible factor-1 and vascular endothelial growth factor in response to venous hypertension. Neurosurgery. 59, 687-696 (2006).
- Herman, J. M., Spetzler, R. F., Bederson, J. B., Kurbat, J. M., Zabramski, J. M. Genesis of a dural arteriovenous malformation in a rat model. J. Neurosurg. 83, 539-545 (1995).
- Terada, T., Higashida, R. T., Halbach, V. V., Dowd, C. F., Tsuura, M., Komai, N., Wilson, C. B., Hieshima, G. B. Development of acquired arteriovenous fistulas in rats due to venous hypertension. J. Neurosurg. 80, 884-889 (1994).
- Yassari, R., Sayama, T., Jahromi, B. S., Aihara, Y., Stoodley, M., Macdonald, R. L. Angiographic, hemodynamic and histological characterization of an arteriovenous fistula in rats. Acta Neurochir (Wien). 146, 495-504 (2004).
- Solheim, O., Skeidsvoll, T. Transient global amnesia may be caused by cerebral vein thrombosis. Med. Hypotheses. 65, 1142-1149 (2005).
- Yang, B., Shergill, U., Fu, A. A., Knudsen, B., Misra, S. The mouse arteriovenous fistula model. J Vasc Interv Radiol. 20, 946-950 (2009).
- Choi, E. J., Choi, E. J., Walker, E. J., Shen, F., Oh, S. P., Arthur, H. M., Young, W. L., Su, H. Minimal Homozygous Endothelial Deletion of Eng with VEGF Stimulation Is Sufficient to Cause Cerebrovascular Dysplasia in the Adult Mouse. Cerebrovascular diseases. 33, 540-547 (2012).
- Hao, Q., Su, H., Marchuk, D. A., Rola, R., Wang, Y., Liu, W., Young, W. L., Yang, G. Y. Increased tissue perfusion promotes capillary dysplasia in the ALK1-deficient mouse brain following VEGF stimulation. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, H2250-H2256 (2008).
- Su, H., Hao, Q., Shen, F., Zhu, Y., Lee, C. Z., Young, W. L., Yang, G. Y. Development of a cerebral microvascular dysplasia model in rodents. Acta Neurochir. Suppl. 105, 185-189 (2008).
- Walker, E. J., Su, H., Shen, F., Degos, V., Jun, K., Young, W. L. Bevacizumab Attenuates VEGF-Induced Angiogenesis and Vascular Malformations in the Adult Mouse Brain. Stroke; a journal of cerebral circulation. , (2012).
