Um modelo de transplante heterotópico Modificado Swine Hind Limb para Translational vascularizado Composite Alotransplante (VCA) Pesquisa

Summary

Vascularizado Composite Allotransplantations (VCA) tornaram-se uma realidade clínica. No entanto, a vasta aplicação clínica de VCA é limitada pela imunossupressão multi-droga crónica. Os autores apresentam um grande modelo animal confiável e reprodutível para traduzir estratégias inovadoras imunomoduladores que podem minimizar ou potencialmente eliminar a necessidade de imunossupressão em VCA.

Abstract

Vascularizado Composite Alotransplante (VCA), tais como mãos e rosto transplantes de representar uma opção viável de tratamento para trauma músculo-esquelético complexo e perda de tecido devastador. Apesar de os resultados funcionais favoráveis ​​e altamente encorajadores precoce e intermediário, a rejeição do componente pele altamente imunogênica de um VCA e potenciais efeitos adversos da imunossupressão multi-droga crônica continuam a dificultar a aplicação clínica generalizada de VCA. Portanto, a pesquisa neste campo novela precisa de se concentrar em estudos translacionais relacionados a características imunológicas únicas de VCA e desenvolver estratégias novas para imunomoduladores imunomodulação e indução de tolerância seguintes VCA, sem a necessidade de imunossupressão a longo prazo.

Este artigo descreve um modelo de animal grande translação fiável e reprodutível de VCA, que é composta de uma aba osteomyocutaneous num suína alotransplante membro posterior heterotópico de MHC definidas. BriEFLY, uma pá pele bem vascularizado é identificada na região ântero-medial da coxa usando perto angiografia laser infravermelho. Os músculos subjacentes, articulação do joelho, fêmur distal e tíbia proximal são colhidas em um pedículo vascular femoral. Este enxerto pode ser considerado tanto um VCA e um transplante de medula óssea vascularizada com as suas características privilegiadas imunológicas únicas. O enxerto é transplantado para uma bolsa abdominal subcutânea no animal receptor com um componente de pele exteriorizados na região dorso-lateral para a monitorização imunitária.

Três equipes cirúrgicas trabalhar simultaneamente de uma forma bem coordenada para reduzir a anestesia e os tempos de isquemia, melhorando assim a eficiência deste modelo e reduzindo potenciais fatores de confusão em protocolos experimentais. Este modelo serve como a base para futuras estratégias terapêuticas que visam a redução e, potencialmente eliminando a necessidade de imunossupressão crônica multi-droga em VCA.

Introduction

Vascularizado Composite Alotransplante (VCA), tais como mãos e rosto transplantes são agora uma realidade clínica com inúmeros transplantes de mão e rosto realizados em todo o mundo ^12. Apesar do facto de que os resultados iniciais e intermediários são favoráveis ​​e muito encorajadores ^2, o requisito de imunossupressão multidroga crónica continua a limitar a sua aplicação clínica generalizada. Os avanços em modelos murinos de VCA incluindo anastomoses super-microcirurgia e técnicas de punho nonsuture ^{13, 3} abriram o caminho para uma melhor compreensão do aloimunes respostas em VCA. Miríades de protocolos imunomoduladores têm sido propostos para aplicações clínicas com base em nossa melhor compreensão dos mecanismos imunes em VCA, mas eles precisam ser validados em um modelo animal de grande porte que seria razoavelmente preditivo do seu desempenho em humanos ^7. Com base nas semelhanças fisiológicas e imunológicas entre os sistemas de órgãos humanos e suínos <sup> 6, os modelos VCA suína podem ser consideradas alternativas confiáveis ​​e de baixo custo a canino ⁹ e modelos de primatas não humanos ^1.

Este artigo fornece uma visão detalhada da metodologia utilizada em nosso modelo MHC-definido suína heterotópico traseira membro transplante, que serve como base para as nossas estratégias imunomoduladoras atuais e futuras destinadas a induzir tolerância imunológica a VCA e, consequentemente, ampliando sua aplicação clínica. Nós utilizamos porcos puras bem caracterizados criados para homozigose no antígeno leucocitário lócus suína especificamente para seu uso em pesquisa relacionada ao transplante ^11. Nós levantamos uma ponta osteomyocutaneous vascularizado baseado em vasos femorais. A aba contém medula óssea vascularizada intacto no fêmur distal e tíbia proximal. A pele da coxa anteromedial também está incluído no enxerto e é exteriorizada do aspecto dorsolateral do animal receptor por monitorização imunitária do componente o mais imunogênicaf o VCA. Posicionamento Dorsolateral facilita o exame clínico em pé e sentada, e também mantém a pele do enxerto relativamente limpa.

Ustener et al. Introduziu um dos primeiros grandes modelos translacionais animais em VCA por transplante radiais abas membro anterior osteomyocutaneous em suínos fazenda outbred ^15. O grupo utilizou este modelo para demonstrar pela primeira vez que a rejeição aguda em VCA que inclui o componente de pele altamente imunogénica pode ser retardada e tratada com uma estratégia clinicamente relevantes sem complicações específicos da droga e os efeitos colaterais significativos. Os resultados favoráveis ​​obtidos neste estudo posteriormente construído um passo fundamental na concepção de regimes de medicamentos para transplante de reconstrução humana. Embora estes modelos VCA porco precoce foram bem adequado para o desenvolvimento de protocolos para evitar a rejeição de pele, músculo, ossos, nervos e vasos que não tinham estruturas especializadas, como articular cartilage e membranas sinoviais das articulações. Os esforços subsequentes foram focados na inclusão do dígito medial do animal, o que exigiu a colocação elenco completo para evitar o deslocamento do enxerto ^14. Embora adequado para investigar a rejeição de todos os principais componentes do transplante de limbo, uma das principais limitações deste modelo era pós-transplante dificuldade ambulatorial devido ao lançar colocação. Assim, os modelos de alotransplante membro suína heterotópicos, que consiste na tíbia, fíbula, articulação do joelho, fêmur distal, músculo circundante, e uma pá de pele, foram criados para estudar principalmente os aspectos imunológicos da VCA, permitindo que o animal de deambular livremente no pós-operatório com morbidit mínimo ⁸ .

O desenvolvimento de porcos puras SLA definidos bem caracterizados através do trabalho pioneiro do Dr. David H. Sachs levou a uma nova era de pesquisa translacional VCA. Utilizando um modelo de transplante heterotópico membro posterior em um ambiente antígeno incompatibilidade menor, Mathes et al. ¹⁰ demonstraram sobrevivência indefinida de componentes músculo-esqueléticas com um curto período de tratamento ciclosporina. A sobrevivência componente da pele, no entanto, só foi prolongada quando comparado com os controlos sem tratamento. A perda da componente da pele do enxerto foi atribuída a uma resposta imune isolado e altamente vigorosa, em particular, para a epiderme. Da mesma forma, usando porcos totalmente incompatíveis com depleção de células T, um curso curto de ciclosporina e de citocinas mobilizou doadores de células mononucleares do sangue periférico induzidos tolerância apenas aos componentes osteomusculares eo componente pele ainda foi rejeitado ^5. Esse fenômeno, chamado de "tolerância dividida ', trouxe uma mudança de paradigma na investigação VCA com um foco maior sobre o componente da pele altamente imunogênica, que é um componente integral da maioria dos transplantes de reconstrução realizados até o momento.

Neste modelo modificado, nós utilizamos anastomose fim-de-final por ligating a artéria femoral destinatário e rodando-cefálica (Figura 1). Isto não só reduz o tempo de isquemia, permitindo a utilização de um dispositivo de acoplamento convencional, mas também diminui a probabilidade de falha da anastomose. Não observamos eventos isquêmicos seguintes ligadura da artéria femoral em nossos destinatários, indicando que a circulação colateral foi suficiente para fornecer a vascularização na perna nativa. Além disso, neste método modificado, o componente de pele é exteriorizada mobilizados com base nos vasos subjacentes perfurantes e está posicionada lateralmente (Figura 1), em contraste com uma posição ventral virilha no modelo tradicional ^10. Isso permite fácil visualização do enxerto para o monitoramento imunológico em pé ou sentado do animal.

Assim, um grande modelo animal confiável e reprodutível é essencial para investigar estratégias de indução de tolerância em relação a componente de pele de VCA e desenvolver novos nestratégias de monitoramento do sistema imunológico oninvasive para uma melhor previsão de sobrevida do enxerto.

Protocol

Nesta publicação de vídeo, todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com um protocolo de animais aprovado pelo Animal Care and Use Committee da Universidade Johns Hopkins Institucional (IACUC). 1. Planejamento pré-operatório Nós utilizamos MHC-definido MGH puras suína miniatura (15-20 kg) em nossos estudos translacionais para allotransplantation membro em que um doador do sexo masculino fornece membros para dois destinatários femininos (Figura 1…

Representative Results

Vinte e quatro transplantes de membros posteriores heterotópicos suína SLA definidos foram realizadas utilizando a nossa técnica modificada com um tempo de isquemia médio de 78 min (intervalo: 62-94 min). Inserção do enxerto e dorsolateral posicionamento pá pele foram alcançados sem dificuldades em todos os animais. Perto angiografia laser infravermelho mostrou excelente perfusão do enxerto em todos os destinatários. Os doze anastomoses venosas iniciais foram realizadas utilizando técnicas de sutura convencio…

Discussion

Historicamente, o protocolo de transplante heterotópico membro posterior incluídos exteriorização de uma pá de pele da parede abdominal ventral e os vasos anastomosados ​​de uma maneira extremo-a-lado (Hettiarachty 2004). No entanto, em nosso método modificado, uma aba invertida insetting e end-to-end anastomoses trazer o remo pele mais lateralmente e, portanto, facilita o monitoramento imunológico em uma posição de pé do animal. A identificação da artéria sural e as zonas de máxima de perfusão utiliz…

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
			REAGENTS
HTK	Custodial	N/A
			EQUIPMENT
Electric Pen Drive	Synthes, Westchester PA	05.001.011	Reciprocating saw
Vascular Coupling device	Synovis, Newtown PA	21003B