Microscopie intravitale de la microcirculation dans le muscle de souris Cremaster pour l'analyse des souches périphériques migration cellulaire
Summary
Microscopie intravitale de la microcirculation souris crémaster M. offre un service unique et bien normalisé modèle in vivo pour l'analyse de la moelle osseuse migration de cellules souches périphériques.
Abstract
À l'ère de protocoles d'application intravasculaire de cellules dans le cadre de la thérapie cellulaire régénérative, les mécanismes sous-jacents de la migration des cellules souches de tissu nonmarrow n'ont pas été complètement clarifiée. Nous décrivons ici la technique de microscopie intravitale appliquée à la cremaster microcirculation de la souris pour l'analyse de la moelle osseuse migration périphérique de cellules souches in vivo. Microscopie intravitale de l'M. crémaster a été préalablement introduit dans le domaine de la recherche inflammatoire pour l'observation directe de l'interaction des leucocytes à l'endothélium vasculaire. Depuis souches périphériques suffisante et la migration des cellules progénitrices comprend les étapes initiales similaires de rouler le long et ferme adhésion à la endothéliales tapissant il est envisageable d'appliquer le modèle de cremaster M. pour l'observation et la quantification de l'interaction des cellules intravasculary souches administrées avec l'endothélium. Comme différents composants chimiques peuvent être appliqués de manière sélective à la cible tquestion par des techniques de surfusion simples, il est possible d'établir des conditions préalables essentielles du micro-environnement, pour le recrutement de cellules souches initiale aura lieu dans un organisme vivant à l'extérieur de la moelle osseuse.
Introduction
Le but du présent article est de décrire la technique de microscopie intravitale (IVM) appliqué sur le crémaster microcirculation de la souris pour l'observation directe et l'analyse de la migration de la moelle osseuse de cellules souches périphériques.
Tissus et organes régénération, le concept actuel de cellules souches basée implique la domiciliation des cellules souches dérivées de la moelle osseuse dans le tissu lésé 1. Une étape cruciale pour la réussite de la migration de cellules souches comprend des cellules souches interaction avec l'endothélium locale au sein de l'organe lésé suivie par la migration trans-endothéliale et, éventuellement, la prise de greffe organe 2. Intravitale analyse de ces cellules souches – interactions des cellules endothéliales forme un paramètre idéal pour la quantification d'une réponse par récupération à base de cellules souches dans des contextes différents physiopathologiques in vivo. En outre, il semble concevable que, dans l'avenir, l'analyse intravitale de la capacité migratoire des cellules souches spécifiques populations dans les environnements de la microcirculation normalisés, pourraient être appliquées avant la promotion de ces populations à d'autres essais cliniques.
Microscopie intravitale a été initialement mis au point pour l'observation et la quantification de l'interaction de la cellule leucocyte-endothéliale in vivo dans le domaine de la recherche inflammatoire 3. Premiers enregistrements succès des études de microscopie intravitale ont été signalés par Cohnheim déjà au 19ème siècle, l'étude des langues et mésentères de grenouilles sous un microscope optique 4. Depuis sa première utilisation IVM a connu un développement technique énorme et aujourd'hui certains éléments essentiels constituent les conditions préalables pour effectuer IVM quantitative: (i) des préparations de tissus qui permettent l'accès optique, (ii) des sondes moléculaires qui peuvent être détectés par un microscope, (iii ) un microscope raccordé à un système de détection et (iv) sur la base de l'analyse des systèmes informatiques qui peuvent extraire des paramètres d'intérêt à partir des données d'imageset 4.
Une variété de préparations de tissus a été introduit pour les études IVM y compris les mésentère et le foie de la souris et le rat 5, les chambres dorsale du pli cutané de la souris et le hamster 6, l'oreille de lapin et le hamster cheek pouch pour n'en nommer que quelques-uns.
Toutefois, dans ce qui suit, nous allons nous concentrer sur le crémaster muscle de souris, ce qui représente un tissu idéal pour les observations intravitale, la préparation et la visualisation sont possibles par une intervention chirurgicale bien standardisée, et en général pas de problèmes d'artefacts de mouvement se produire. La préparation crémaster muscle ouverte a été réalisée pour la première fois dans les années 1970 par Baez et ses collègues 7. Initialement décrit chez le rat, il a été adopté avec succès également pour la souris 8. Après des études antérieures avaient principalement porté sur les interactions des leucocytes avec la paroi du vaisseau, notre groupe a récemment introduit la souris crémaster préparation musculaire comme évable outil pour la visualisation directe et l'analyse quantitative des interactions cellule-souches endothéliales dans un microenvironnement défini 9. Différentes sous-populations de cellules souches a été étudiée en utilisant ce modèle, y compris murin c-kit + de la moelle osseuse les cellules souches et les cellules souches mésenchymateuses, ainsi que les CD humaines des cellules souches 133 + de la moelle osseuse de 10 à 12. Suite à l'isolation de cellules de moelle osseuse du donneur et un marquage fluorescent pour la visualisation, les cellules souches sont appliqués de manière sélective dans la microcirculation crémaster utilisant une injection artérielle par l'intermédiaire de l'artère fémorale, ce qui évite tout coincement des cellules dans des organes distants. En outre, le modèle de muscle crémaster est particulièrement utile car diverses chimiokines potentiellement médiatrices migration de cellules souches locales dans les paramètres respectifs, peuvent être appliquées par voie topique au tissu cible par une technique de surfusion simple.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microscopie à fluorescence intravitale permet la visualisation directe et une analyse quantitative des interactions cellules-souches endothéliales. Le modèle de muscle crémaster est particulièrement utile, étant donné que l'exposition et les techniques de microchirurgie visualisation intravitale ont été bien établies au cours de la recherche sur les interactions des leucocytes et l'endothélium différents composants chimiques peuvent être appliqués de façon sélective à du tissu cible par…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | C1157 |
| Rhodamine 6 G (1%) | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 83697 |
| Ketamin (Ketanest) | Pfizer, Berlin, Germany | not available |
| Xylacin (Rompun) | Bayer, Leverkusen, Germany | not available |
| Dulbecco's Phosphate – buffered saline (PBS) | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 |
Referenzen
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