Visualización de Desarrollo Craneofacial en los SOX10: Kaede pez cebra transgénico Línea Usando Time-lapse microscopía confocal
Summary
La visualización de los datos experimentales se ha convertido en un elemento clave en la presentación de resultados a la comunidad científica. Generación de grabación a intervalos regulares en vivo de embriones en crecimiento contribuye a la mejor presentación y la comprensión de los procesos de desarrollo complejos. Este protocolo es una guía paso a paso para el etiquetado de células a través de la proteína fotoconversión Kaede en el pez cebra.
Abstract
Palatogénesis vertebrado es un proceso de desarrollo altamente coreografía y complejo, que implica la migración de la cresta neural craneal (CNC) las células, la convergencia y la extensión de prominencias faciales, y la maduración del esqueleto craneofacial. Para estudiar la contribución de la cresta neural craneal a regiones específicas del paladar pez cebra un SOX10: Línea de pez cebra transgénico Kaede se generó. Sox10 proporciona restricción linaje de la proteína indicadora Kaede a la cresta neural, con lo que la célula etiquetado de un proceso más preciso que el tinte tradicional o reportero de la inyección de ARNm. Kaede es una proteína de la foto convertible que cambia de verde a rojo después de la activación de la foto y hace posible seguir con precisión las células. Los SOX10: Línea transgénica Kaede se utilizó para realizar el análisis de linaje para delinear las poblaciones de células CNC que dan lugar a maxilar contra elementos mandibulares e ilustran la homología de las prominencias faciales para amniotas. Este protocolo describe el pasos para generar un video time-lapse en vivo de un SOX10: embrión de pez cebra Kaede. Desarrollo de la placa etmoidal servirá como un ejemplo práctico. Este protocolo se puede aplicar a realizar una grabación confocal de lapso de tiempo de cualquier Kaede o proteína reportera fotoconvertible similar en el pez cebra transgénico. Además, puede ser utilizado para capturar no sólo normal, pero también anormal desarrollo de estructuras craneofaciales en los mutantes de pez cebra.
Introduction
Hendiduras orofaciales representan la deformidad craneofacial más frecuente, con 1/700-1, 000 entregas afectadas 1. La interrupción del desarrollo temprano embriológico craneofacial puede conducir a la formación de labio leporino y paladar hendido (CL / P). Si bien las causas de hendidura sindrómica se ha demostrado en gran parte, aún deben ser descubiertos 2-4 las bases genéticas y epigenéticas de las formas no sindrómicas de hendidura orofacial. Con el fin de entender la etiología y la patogénesis de estas malformaciones, es necesario aclarar el desarrollo de estructuras craneofaciales sobre una base celular.
En todas las especies de vertebrados células de la cresta neural craneal (CNCC) migran desde el tubo neural dorsal para rellenar los arcos faríngeos, lo que contribuirá a la formación de las estructuras orofaciales. La interrupción del desarrollo temprano de la cresta neural embrionaria puede conducir a la formación de las malformaciones craneofaciales, incluyendo CL / P 5-7.
En anunciocondición a las similitudes estructurales entre el pez cebra y el desarrollo craneofacial mamíferos (CNCCs residen en regiones homólogas), la red de regulación de genes es altamente conservada. También se ha demostrado que CNCCs desarrollar de la misma manera entre las especies amniote y pez cebra 8, haciendo que el pez cebra un organismo de gran alcance para el estudio de la base del desarrollo y genética de CL / P. Tiene muchas ventajas, incluyendo tamaño pequeño, rápido y ex utero desarrollo embrionario, y las altas tasas de reproducción. Por otra parte, el embrión es ópticamente transparente, por lo que es susceptible a la observación de eventos de desarrollo complejos bajo el microscopio 9. Es un modelo animal ideal para el estudio de la migración y la diferenciación de células de la cresta neural craneal.
Ampliando previamente publicado trabajos 8, 10, 11, el patrón migratorio de CNCC se describió en detalle el uso de los SOX10: Kaede modelo transgénico 5. Kaede es una proteína de la foto convertible que turns de verde a rojo después de la activación de fotos y hace que sea posible rastrear CNCCs precisión. Durante esta transformación la cadena principal del péptido se escinde, lo que sugiere que la conversión es estable, es decir, las células pueden ser rastreados a su destino final 12. Las líneas transgénicas marcados con Kaede bajo el control transcripcional de SOX10 mostraron que el paladar amniota y la placa etmoidal de pez cebra se forman de manera homóloga por la fusión de las prominencias maxilares bilaterales (MXP) con la prominencia frontonasal (FNP) y que la costura de fusión en forma de Y es análoga entre especies.
Entre otras aplicaciones, los SOX10: Kaede modelo de pez cebra transgénico se utilizó para generar videos de embriones de pez cebra en diferentes etapas de desarrollo para mostrar la formación de estructuras craneofaciales normales y anormales. Fotoconversión de grupos específicos de células hace posible el seguimiento de su desarrollo. Con este método, un enfoque para crear imágenes en vivo del desarrollo de craniofacestructuras ial en el pez cebra se introduce, por lo que es fácil de demostrar visualmente este complejo proceso de desarrollo.
Este protocolo tiene como objetivo compartir la experiencia de la generación de estos vídeos con el desarrollo normal de la placa etmoidal en SOX10: pez cebra transgénico Kaede como ejemplo. Este protocolo adicional se puede aplicar a la realización de vídeos time-lapse de cualquier estructura derivada de células de la cresta neural craneal en el pez cebra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se muestra un nuevo método para la visualización del desarrollo craneofacial en el modelo de pez cebra. Los SOX10: Kaede línea de pez cebra transgénico se ha utilizado con éxito para describir el patrón migratorio de CNCC en detalle se utiliza como un organismo modelo 5.
Estudios previos han utilizado puntos de referencia brutos como el ojo a las células diana y se han basado en la inyección de ARNm Kaede, ensayos fotoconversión o dextrano fluoresceína enjaulado pa…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Robert Kelsh por compartir amablemente el reactivo de pez cebra promotor SOX10.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| sox10: kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100×15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
Referenzen
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