Un humain<em> Ex Vivo</em> Plaque athéroscléreuse modèle pour étudier la biologie de la lésion
Summary
L'athérosclérose est un processus inflammatoire chronique. Ce manuscrit illustre un outil facile à utiliser modèle ex vivo pour étudier carotide frais ou des plaques coronariennes. Le modèle in vivo ex permet à l'enquête de substances potentiels sur le milieu inflammatoire dans les lésions athérosclérotiques humaines et les résultats peuvent être analysés par diverses méthodes.
Abstract
L'athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique du système vasculaire. Il existe différentes méthodes pour étudier le composé inflammatoire dans les lésions d'athérosclérose. Modèles de souris sont un outil important pour étudier les processus inflammatoires dans l'athérogenèse, mais ces modèles souffrent des différences phénotypiques et fonctionnelles entre la souris et le système immunitaire humain. Expériences in vitro de cellules sont utilisées pour évaluer spécifiquement les changements de type dépendant cellulaires causés par une substance de intérêt, mais des variations dépendant de la culture et de l'impossibilité d'analyser l'influence de molécules spécifiques dans le contexte du composé inflammatoire dans les lésions athérosclérotiques de limiter l'impact des résultats. En outre, la mesure des taux d'une molécule d'intérêt dans le sang humain permet d'approfondir sa pertinence clinique, mais il s'agit d'une inflammation systémique et non local. Par conséquent, nous décrivons ici un modèle de culture de la plaque d'athérome à étudier lésion biologie humaineex vivo. En bref, des plaques fraîches sont obtenus à partir de patients subissant une endartériectomie ou pontage coronarien greffage et stockés dans du milieu RPMI sur de la glace jusqu'à utilisation. Les échantillons sont découpés en petits morceaux puis par distribution aléatoire dans une plaque à 48 puits, contenant du milieu RPMI en plus d'une substance d'intérêt tels que des cytokines ou des chimiokines, seuls ou en combinaison pour des périodes de temps définies. Après incubation, les morceaux de plaque peuvent être congelés pour un choc isolement d'ARNm, inclus dans la paraffine ou des PTOM pour les colorations d'immunohistochimie ou brisées et lysées pour western blot. En outre, les cellules peuvent être isolées à partir de la plaque pour l'analyse de cytométrie en flux. En outre, les surnageants peuvent être collectées pour la mesure de la protéine par la technique ELISA. En conclusion, le modèle in vivo présentée ex ouvre la possibilité d'étudier plus avant la biologie lésionnelle inflammatoire, qui peut conduire à l'identification de mécanismes roman de la maladie et des cibles thérapeutiques.
Introduction
L'athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique est l'une des principales causes de décès dans les pays industrialisés 1-2. Les complications de l'athérosclérose, le syndrome coronarien aigu en particulier, ont été liés à la rupture de lésions vulnérables, ce qui provoque l'athérothrombose et l'occlusion du vaisseau 3. L'immunité innée et adaptative semblent être impliqués à toutes les étapes de l'athérogenèse 2,4-5. Bien que des progrès importants ont été réalisés dans le traitement de l'infarctus du myocarde, une prévention efficace de l'athérosclérose et les événements cardiovasculaires indésirables sont encore en suspens. Ainsi, l'étude de la biologie lésionnel est essentielle pour accroître nos connaissances sur la physiopathologie de l'athérosclérose et à permettre l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouvelles thérapies.
Dans de nombreux cas, des modèles murins sont utilisées pour étudier la physiopathologie des maladies spécifiques. Cependant, l'étude athérogenèse en utilisant des modèles de souris est accompanied par plusieurs limites: (1) Habituellement, les souris athérosclérotiques reçoivent une alimentation riche en cholestérol. Les niveaux de cholestérol dans ces modèles ne peuvent pas être comparés à ceux des patients ayant des taux sériques de cholestérol élevé 6. (2) Il existe des différences substantielles entre la souris et le système immunitaire humain; ainsi Foxp3 est un marqueur spécifique des cellules T régulatrices murins, alors que l'expression de Foxp3 humain dans des cellules T humaines ne confère pas nécessairement un phénotype de régulation 7. En outre, le paradigme Th1/Th2 tel que défini dans l'homme n'est pas entièrement transférable à cellules T murines. (3) Un certain nombre de marqueurs qui sont utilisés pour identifier les monocytes et les macrophages murins tels que F4/80 et les marqueurs de classique (M1) vs alternatif (M2) modèles d'activation n'existe pas dans les cellules myéloïdes humaines 8. (4) L'expression des gènes de monocytes de sang périphérique humains et murins a été trouvée pour être sensiblement différente 9.
Ainsi, afin d'accroître notre compréhension desprocessus inflammatoires chroniques de l'athérosclérose humaine, nous avons besoin de faire usage de modèles de travail avec les tissus humains, de sang ou de cellules. Ici, nous décrivons un modèle de culture de tissus de la plaque humaine, qui permet d'étudier de nouvelles substances potentiels dans le concept de biologie lésionnelle inflammatoire humaine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons ici un modèle ex vivo de la culture de la plaque d'étudier l'influence de substances potentiellement pertinentes sur l'athérosclérose lésion biologie. Le principal avantage de cette méthode ex vivo est la capacité d'évaluer l'influence de substances indiquées sur les cellules inflammatoires et leur interaction cellulaire ainsi que les voies inflammatoires et des cascades dans les lésions athérosclérotiques humaines. Plusieurs méthodes utilisables (p…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Nadine Wambsganss pour une excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) ER 682/2-1 et une allocation de recherche de la Société allemande de cardiologie à C. Erbel ainsi que d'une allocation de recherche de l'allemand académique service Heidelberg à L. Zhao.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Gibco | 21875-091 | n/a |
| FCS | Gibco | 10270-106 | n/a |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | n/a |
| 15 ml tube | Sarstedt | 62,554,502 | n/a |
| culture dish (60mm) | Orange Scientific | 5550200 | n/a |
| LPS | Sigma | L4516 | n/a |
| Cell Culture Plates 48-well | Greiner | 677102 | n/a |
| Scalpel – single use | Feather | FEA200130011 | n/a |
| TissueLyser | Precellys 24 Dual | Cat. No. EQ03119.200.RD010.0 | n/a |
| RNeasy (Mini) Kit | Qiagen | Cat. No. 74104 | n/a |
| Boehringer cDNA kit | Roche Diagnostics | Cat. No. 11483188001 | n/a |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | n/a | |
Referenzen
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