Oprichting van een<em> In vitro</em> Systeem om Intracellular Gedrag van Studie<em> Candida glabrata</em> In Human THP-1 macrofagen
Summary
Het huidige artikel schetst een protocol bij een in vitro celcultuur model systeem om de interactie van een facultatief intracellulaire menselijke pathogene schimmel Candida glabrata met menselijke macrofagen, die een nuttig instrument om onze kennis van schimmel virulentiemechanismen vooruit zal bestuderen vestigen.
Abstract
Celkweek modelsysteem het, om nabootser host omgevingsomstandigheden, kan dienen als een goedkope, reproduceerbare en gemakkelijk manipuleerbaar alternatief diermodellen voor de studie van een specifieke stap van microbiële pathogeen infectie. Een cellijn van menselijke monocyten THP-1, die na forbolester behandeling, is onderverdeeld in macrofagen, is eerder gebruikt om virulentie strategieën van vele intracellulaire pathogenen zoals Mycobacterium tuberculosis bestuderen. Hier bespreken we een protocol bij een in vitro celkweek model vaardigen systeem met THP-1 macrofagen de interactie van een opportunistische pathogeen humaan gist Candida glabrata met menselijke fagocyten bakenen. Dit model is eenvoudig, snel, ontvankelijk voor hoog-mutant schermen, en vereist geen geavanceerde apparatuur. Een typische THP-1 macrofaag infectie experiment duurt ongeveer 24 uur met een extra 24-48 uur tot herstelde intracellulaire toestaangist om te groeien op rijk medium voor kolonievormende eenheden gebaseerd levensvatbaarheid. Als andere in vitro modelsystemen, een mogelijke beperking van deze benadering moeilijk extrapolatie van de verkregen zeer complex immuuncel circuits die in de menselijke gastheer resultaten. Echter, ondanks dit, het huidige protocol is zeer nuttig om de strategieën die een pathogene schimmel kan gebruiken om te ontwijken / tegen antimicrobiële respons en te overleven, aan te passen, en zich vermenigvuldigen in de voedselarme omgeving van gastheer immune cellen op te helderen.
Introduction
Candida-soorten zijn de belangrijkste oorzaak van levensbedreigende invasieve schimmelinfecties bij immuungecompromitteerde patiënten 1. Candida glabrata, een opkomende nosocomiale pathogeen, is de tweede of derde meest frequent geïsoleerd Candida-soorten uit patiënten Intensive Care Unit, afhankelijk van de geografische ligging 1-3. Fylogenetisch, C. glabrata, een haploïde gist, is nauwer verwant aan de niet-pathogene model gist Saccharomyces cerevisiae dan pathogene Candida spp. waaronder C. albicans 4. Consistent hiermee C. glabrata mist een aantal belangrijke schimmels virulentie eigenschappen, waaronder de paring, uitgescheiden proteolytische activiteit en morfologische plasticiteit 4-5.
Hoewel C. glabrata vormt geen schimmeldraden, het kan overleven en repliceren in muis en mens macrofagen 6-8 suggereert dat het unieke pathogenese mechanismen heeft ontwikkeld. Beperkte informatie beschikbaar is over de strategieën die C. glabrata telt overleven voedselarme intracellulaire macrofaag milieu en het tegengaan van oxidatieve en nonoxidative gastheer responsen bevestigd door gastheer immuuncellen 5. Een pertinente macrofaag modelsysteem is een voorwaarde om de interactie van C. af te bakenen glabrata met gastheer fagocytcellen via functionele genomics en proteomics aanpak. Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) en beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) van humane en muriene oorsprong respectievelijk zijn eerder gebruikt om de interactie van C. bestuderen glabrata met gastheer immuuncellen 7,9. Echter, moeilijkheden bij het verkrijgen PBMCs en BMDMs, hun beperkte levensduur en intrinsieke variatie tussen verschillende donoren zoogdieren beperken het gebruik van deze cellen zo veelzijdig modelsystemen.
Hier beschrijven we een methode voor het opstellen van een in vitro systeem om de intracellul studerenar gedrag van C. glabrata cellen macrofagen afkomstig van menselijke monocytische cellijn THP-1. De algemene doelstelling van dit protocol was om een eenvoudige, goedkope, snelle en reproduceerbare celcultuurmodel systeem dat gemakkelijk kan worden gemanipuleerd om verschillende aspecten van gastheer-pathogene schimmel interactie te bestuderen vaardigen.
THP-1-cellen zijn eerder gebruikt om de immuunrespons tegen een groot aantal pathogenen zoals bacteriën, virussen en schimmels 10-12 ontcijferen. Monocytische THP-1 cellen zijn gemakkelijk te onderhouden en kunnen worden onderscheiden, op forbolester behandeling, tot macrofagen die-monocyten afgeleide macrofagen van de menselijke na te bootsen en te uiten passende macrofaag markers 13. De belangrijkste voordelen van THP-1 macrofagen modelsysteem zijn het gemak-of-gebruik en het ontbreken van geavanceerde apparatuur vereiste.
De hier gepresenteerde protocol gemakkelijk aan de interactie van andere menselijke schimmels met hos bestuderent immuuncellen. De huidige procedure kan ook worden gebruikt om virulentie te identificeren voor het organisme van belang met behulp van high throughput mutant schermen. Deze proof-of-concept werd geïllustreerd door het succesvolle gebruik van THP-1 cultuur modelsysteem om een set van 56 genen die nodig zijn voor de overleving van C. glabrata in menselijke macrofagen 8 identificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aangeboren immuunsysteem speelt een belangrijke rol bij de controle van opportunistische schimmelinfecties. Macrofagen bijdragen aan de verdediging antifungale door inname en verwoesting van de pathogene schimmel. Zo zal opheldering van factoren die nodig zijn voor overleving en / of tegengaan van de antimicrobiële functies van macrofagen ons begrip van schimmels virulentie strategieën bevorderen. In deze context hebben we een in vitro celkweek modelsysteem middels macrofagen afgeleid van een humane monocytis…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Innovative Young Biotechnologist Award BT/BI/12/040/2005 en BT/PR13289/BRB/10/745/2009 subsidie van de afdeling Biotechnologie, de regering van India en de kern fondsen van Centrum voor DNA-vingerafdrukken en Diagnostics, Hyderabad. MNR en GB zijn de ontvangers van de Junior en Senior Research Fellowships van de Raad voor Wetenschappelijk en Industrieel Onderzoek naar het nastreven van een doctoraat van de Manipal University. SB is de ontvanger van Junior en Senior Research Fellowship van de afdeling Biotechnologie, op het voeren van een doctoraat van de Manipal University.
Materials
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
Referenzen
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem. Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study. J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).
- Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. Overview of opportunistic fungal infections in India. Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).
- Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host. Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).
- Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance. FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).
- Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).
- Seider, K., Brunke, S., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).
- Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction. PLoS Pathog. 8 (8), e1002863 (2012).
- Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Schüller, C. Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis. Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).
- Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates. Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).
- Murayama, T., Ohara, Y., et al. Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene. J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).
- Gross, O., Poeck, H., et al. Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence. Nature. 459, 433-436 (2009).
- Auwerx, J. The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation. Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).
- Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester. Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).
- Castaño, I., Kaur, R., et al. Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata. Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).
