STA-PUT yöntem büyüklüğü ve yoğunluğuna bağlı olarak spermatojenik farklı hücre popülasyonlarının ayrılması sağlar.
Memeli spermatogenezis testislerin seminifer tübüllerde çeşitli aşamalardan oluşan karmaşık bir farklılaşma süreçtir. Şu anda, in vitro spermatojenik farklılaşması için izin veren güvenilir bir hücre kültür sistemi olup, spermatojenik hücrelerin çoğunun biyolojik çalışmalar, fare ve sıçan gibi hayvan modellerinde doku hasat gerektirir. Non-spermatojenik (Leydig, sertoli, miyeloid ve epitel hücreleri) ve spermatogenetik hem (spermatogonium spermatositler, yuvarlak spermatidlerin, spermatidlerin ve sperm yoğuşmalı) – – testis sayıda hücre tiplerini içerir çünkü spermatogenezde katılan biyolojik mekanizmaların çalışmalar izolasyonu gerektiren ve bu farklı hücre tiplerinin zenginleştirme. Bu durumda, testis – – lineer gradyan BSA ile STA-PUT yöntem hücre heterojen bir popülasyonunun ayrılması sağlar. Bireysel hücre tipleri ce göre farklı çökelme hızı ile tortull büyüklüğü ve farklı hücre tipleri için zenginleştirilmiş fraksiyonlar toplanmış ve daha fazla analizlerde kullanılabilir. STA-PUT yöntem, belirli hücre ayırma yöntemleri ile elde edilebilir, örneğin hücre tipleri son derece saf fraksiyonları, neden etmese de, bu, her bir parça halinde toplam hücrelerin çok daha yüksek bir verim sağlamaktadır
(7-8 x 10 8, bir başlangıç hücre popülasyonundan ~ 1 x 10 8 hücre / spermatojenik hücre tipi). Bu yüksek verim yöntem yalnızca uzman cam gerektirir ve bir floresan aktif hücre ayırıcı (FACS) veya elutriatörü gibi özel ekipmana sınırlı erişimi laboratuarları için ideal bir yöntem yapma, herhangi bir soğuk oda veya büyük buzdolabı yapılabilir.
Memeli spermatogenezis testislerin 1 seminifer tübüllerde çeşitli aşamalardan oluşan karmaşık bir farklılaşma süreçtir. Kısaca, seminifer tübül bölünmenin epiteli yakınında ikamet spermatogonium gibi-kök ve daha sonra mayozdaki bölünmeler geçmesi spermatositlerin, içine ayırt. Mayoz tamamlandıktan sonra, elde edilen haploid hücreleri ya da yuvarlak spermatid, Spermiyogenez, sitoplazma ile çekirdek kompaksiyon saçılmasını içeren bir farklılaşma sürecine tabi tutulur. Spermatidlere yavaş yavaş, sırasıyla, bir kamçılı geliştirmek ve çekirdeğin uzamasını ve yoğunlaşmasını geçmesi, uzatma ve ardından yoğuşmalı spermatidlerin üreten. Son ürünler seminiferous tübül ve sonuçta daha olgun epididimis lümeni içine salınır spermatozoa vardır.
Spermatogenez süreci içinde özel hormonal ve moleküler koşullarına dayandığındantestisler, spermatogenez tüm süreç için güvenilir bir in vitro kültür sistemi henüz 2,3 geliştirilmiş değil. Kültür yöntemleri kök hücrelerden "primordial germ hücresi benzeri hücreler" ve haploid, "yuvarlak spermatid-benzeri hücreler" oluşturmak için geliştirilmiştir, ancak bu yöntemler henüz bu hücrelerin çok sayıda oluşturmak ve daha sonra spermatogenetik hücre üretmek için başarısız mümkün değildir türleri 4,5. Neyse ki, spermatojenik hücre tipleri, bir sıvı gradyanı ile ayrılması için bütün testisler elde edilen tek bir hücre süspansiyonu için izin veren, boyut olarak önemli ölçüde farklıdır. STA-PUT yöntemi, burada gösterdiği, büyüklüğü ve kitle 6-9 dayalı spermatojenik hücreleri ayırmak için bir doğrusal BSA degrade ve basit sedimantasyon kullanır.
FACS ve sivili ayrıştırma 10-13: STA-PUT yöntem spermatojenik hücre tipleri ayırmak için diğer iki en yaygın olarak kullanılan yöntemlere göre bazı avantajları vardır. STA-PUT aparatı onl gerektirirözel cam y birkaç adet soğuk oda veya büyük buzdolabı monte. Bu nedenle, bir hücre ayırıcıyla ya da elutriatörü kullanarak daha az pahalıdır. Her bir hücre popülasyonunun saflığı FACS 11 ile elde edilen kadar yüksek olmasa da STA-PUT yöntem olup, hücre tipi ve karşılaştırılabilir bir zaman dilimi içinde FACS ile sıralanabilir daha testis başına hücre yüksek miktarda elde edilir. Hücre (manyetik aktif hücre sıralama, MACS) son zamanlarda başarılı bir karma testiküler hücre nüfus spermatogonyumlarda zenginleştirilmesi için istihdam edildiğini, ancak 14 işaretleyicileri uygun yüzeyinin bilgi eksikliği nedeniyle spermatositlerin veya spermatidlerin ayırmak için şu anda uygun olan manyetik boncuklar kullanarak sıralama. FACS ya da MACS fazla STA-PUT yönteminin ilave bir avantajı, FACS protokolleri aksine, herhangi bir DNA ya da boyama diğer türleri gerektirmez, çünkü daha sonra kültür için uygun olan canlı hücreleri izole etmek için yeteneğidir. L gerekli çalışmalar içinSpermatogenik hücreleri türleri arge verimleri ~% 90 saflıkta, STA-PUT ideal bir yöntemdir.
Güvenilir bir hücre kültür sistemi henüz tüm spermatogenik hücre tiplerini 3 üretmek için yok gibi spermetogenez çalışma yapanlar, spermatojenik hücre örnekleri için hayvan modellerinde güveniyor. Spermatojenik hücreleri kolayca bütün testis toplanan rağmen, sadece karışık bir nüfus sonuçlanır. Bu tür mayotik hücreleri, yuvarlak spermatidler ve yoğuşmalı spermatidler gibi bu hücrelerin belirli alt tipleri, incelemek isteyenler için bir sorun teşkil etmektedir. Üç farklı y?…
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma NIH hibe SLB için GM055360 ve RGM için U54HD068157 tarafından desteklenmiştir. JMB Pennsylvania Üniversitesi (GM008216) de T32 Genetik Eğitim Grant tarafından desteklenmiştir.
BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
DAPI | Preference of researcher | ||
Triton-X100 | Preference of researcher | ||
Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
TABLE 2: EQUIPMENT | |||
Equipment | Company | Catalog # | Comments |
Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
Need approximately 100 tubes | |||
Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher |