急性白血病の治療のためのチロシンキナーゼ阻害剤の前臨床評価
Summary
受容体チロシンキナーゼは、多くの癌において異所性に発現され、そして急性白血病における治療標的として同定されている。この原稿は、急性白血病の治療のためのチロシンキナーゼ阻害剤の前臨床評価のための効率的な戦略を記載している。
Abstract
受容体チロシンキナーゼは、白血病および固形腫瘍の両方を含む、多くの癌の発症および進行に関与し、かつ魅力的な治療標的であるドラッガブルされている。ここでは、急性白血病の治療におけるチロシンキナーゼ阻害剤（TKI類）の前臨床評価のための効率的な4段階の戦略を記載している。最初に、ウェスタンブロット分析は、培養白血病細胞における標的阻害を確認するために用いられる。機能活性は、その後、メチルセルロースまたは軟寒天中で培養クローン原性アッセイを用いて評価される。細胞培養アッセイにおいて活性を実証する実験的な化合物は、ヒト白血病細胞株を用いて同所移植したNOD-SCID-γ（NSG）マウスを用いてインビボで評価される。初期のインビボ薬力学的研究は、骨髄から単離された白血病性芽球の標的阻害を評価する。このアプローチは、有効な標的阻害するために必要な投与の用量およびスケジュールを決定するために使用されるイオン。その後の研究は、それによってin vivoでの生物発光イメージングシステムを用いて、白血病の負担や治療応答の評価の非侵襲的生物発光のモニタリングを可能にする、白血病細胞のルシフェラーゼを発現を用いて、in vivoでのTKIの有効性を評価する。この戦略は、 インビトロおよびインビボでのTKIの評価のために有効であったと治療可能性を有する、分子標的薬の同定のため、または複数の化合物の直接比較及び優先順位付けのために適用することができる。
Introduction
急性リンパ芽球性白血病（ALL）は小児の1,2の中で最も一般的な悪性腫瘍である。小児B系統のALL（B-ALL）の全体的な生存率は約85％であるが、T-細胞系列ALL（T-ALL）を含む、特定の生物学的サブタイプが、、でも、現在の治療プロトコルで、まだ予後不良を持っている。再発ALLの更なる処理が課題3のまま。急性白血病の成人患者の大半は先行化学療法と寛解を達成するが、多くの患者はまだ再発4に苦しむ。急性白血病の治療に現在の化学療法レジメンは、毒性に関連する短期および長期の副作用を引き起こすことが知られている。したがって、具体的には、正常組織への影響を最小限に抑えながら、癌細胞を標的とするより毒性の低い治療法が大いに必要とされている。近年では、強調がしばしば反復的化学反応を用いて、がん細胞の新規な特異性を有する、分子標的薬の開発に配置されているを比較して5を優先している必要があり、複数の活性化合物を生成する。この原稿は、薬剤開発を容易にするために、単一の化合物の評価のために、または複数の化合物の直接比較のために使用することができる急性白血病の治療のためのTKIの前臨床評価のための効率的な戦略を記載している。
ここで紹介する方法は、4つのステップで構成されています。最初の生化学（1）および抗白血病（2）の化合物の活性は、細胞培養で評価され、次いで標的の阻害は、動物モデル（3）で確認し、TKI（複数可）の最終的に治療効力れる白血病同所性異種移植片モデル（4）で決定される。これらの研究のために、それは最も一般的な生物学的サブタイプの代表であり、関連する細胞株を選択することが重要である。細胞株は、目的の標的を発現し、目的の標的を欠いている、生物学的効果をメッドされているかどうかを調べるためにその両方の、選択されるべきであるターゲットの阻害によってiated。これは、抗腫瘍活性のために重要であるかもしれないオフターゲット効果を有する小分子阻害剤の開発のために特に適切である。このような増殖または生存などの機能的効果のための標的に依存する細胞株を選択することも必要である。標的を阻害するためにRNA干渉または他の特異的手段を用いて（この資料の範囲外）の予備標的検証研究は、標的依存性細胞株を同定するために使用することができる。これは、細胞培養の結果がより直接的にin vivo実験に変換することができるように、マウス異種移植片を形成することができる細胞株を選択することも望ましい。
白血病細胞におけるTKI類によって媒介される生化学的活性の評価のために、受容体リン酸化の減少は、標的阻害の指標として使用することができる。ウェスタンブロット分析またはELISAアッセイは、抗体の利用可能性および特異性に応じて、使用することができる。標的に対して十分な特異性を有する抗体が利用可能である場合、それらは、より定量的かつ効率的であるように、ELISAアッセイが好ましい。 ELISAのために十分な特異性を有する抗体が利用できない場合において、ウェスタンブロット分析が必要であり得る。この場合、溶解物の大量の免疫沈降は、低量である標的の検出に有用であり得る。このアプローチは、環境刺激に応答してシグナル伝達の迅速な変化を可能にするために短い半減期を有していてもよいホスホ – タンパク質の測定に特に関連する。いくつかのリン酸化されたタンパク質は、ホスファターゼとの複合体形成の結果として、非常に不安定な可能性が最も高い。これらのリン酸化タンパク質の堅牢かつ一貫性のある検出のために、それはまた、従来の全細胞溶解物の調製リンタンパク質を安定化させるために、過バナジン酸、不可逆的なタンパク質-チロシンホスファターゼ阻害剤6で細胞を処理することが可能であってもよい。
へ生化学的活性が抗腫瘍効果をもたらすかどうかを決定する、ターゲットに依存する生物学的プロセスは、細胞ベースの実験でモニターすることができる。白血病細胞株の場合は、TKIのが介在する抗白血病活性は、メチルセルロースまたは軟寒天7で行われるコロニー形成アッセイを用いて評価することができる。これはTKIによる反復処置が必要な場合に操作により適している固体媒体のように軟寒天に好ましい場合がある。多くの急性myloid性白血病（AML）細胞株は軟寒天中でコロニーを形成するが、最もALL細胞株は、半固形培地である、メチルセルロース中でコロニーを形成する。それはメチルセルロース培養培地および/またはのTKIを更新することは可能ですが、わずかなボリュームが使用され、限られた周波数を持つことができます。同様に、メチルセルロース、それらを破壊することなく、コロニーを染色することはより困難である。予備的な研究は、メチルセルロースおよび/または軟寒天およびtにコロニーを形成するための適切な細胞株の能力を定義する必要が彼コロニーは非重複であり、十分な数の統計的に関連するデータ（35mmのプレートあたり、通常50〜200コロニー）を得るように、培養中の細胞の最適密度。
インビトロアッセイは、堅牢で費用効果があり、全体の動物実験倫理より少ない影響を有するが、治療化合物の進歩は、動物モデルにおける有効性および安全性の証明を必要とする。 インビボ研究のために、ヒト急性白血病細胞株は、同所Iはtm1Wjl / SzJ（NSG）マウスとのTKIが容易に注射または経口胃管栄養法によって投与することができるl2rg NOD.Cg-PRKDCのスキッドに移植することができる。いくつかの細胞株は、異種移植片を確立するためには、放射線の低い細胞株に依存する用量にNSGマウスの露出を必要とし、この場合には、マウスを5〜10日間の回復期間後の照射なし強制経口投与に耐えられないことがあります。この原稿は、使用して、B-ALLおよびT-ALL異種移植片の生成を説明しますしかし、異種移植片の実施例のような特定の細胞株（697およびJurkat）は、細胞株の多種多様を用いてNSGマウスで確立されてもよい。他の細胞株は、より適用可能であることをイベントでは、照射のための要件は、移植、および疾患の発症および進行のタイミングに対する細胞の最適数は、実験的に決定されるべきである。理想的には、これらのモデルは、（疾患による研究から治療と除去の開始との間に理想的に、20〜30日）で、完全な浸透度（移植されたすべての動物が、白血病を開発しています）、一貫性の動態（白血病はすべての動物においても同様に進行する）、かつ合理的な治療ウィンドウを持つことになります。移植された細胞の数は、浸透度と運動一貫性を改善するために増加又は必要に応じて処置窓を改善するために減少させることができる。
TKIは、生体内で目的の阻害を媒介するかどうかを判断するには、サンプルは、TKIまたは媒体のみで処理した後に白血病異種移植片を有するマウスから採取されています。理想的には、用量ANこれらの実験のための管理のDスケジュールは、多くの場合、市販の実験室で行われ、この記事の範囲外であることができる薬物動態試験、案内される。薬物動態データが利用可能である場合、TKIの単回投与後の細胞培養における有効な標的阻害および最大血清濃度に必要な化合物の濃度は、動物研究のための開始用量を定義するために使用することができる。薬物動態研究はまた、薬力学的研究および投与経路のためのサンプル収集後処理のタイミングを知らせることができる。標的の阻害は、任意の影響を受ける臓器で評価することができるが、最も容易に収集され、処理される組織が好ましい。特定の臓器が影響を受けるが、ほとんどの急性白血病細胞株は、肝臓、骨髄、脾臓、末梢血、および中枢神経系において確立し、これらの器官における生着の程度は、モデルの間で変化する。ここで紹介するプロトコルは、ホスホンを評価o-ジタンパク質ウェスタンブロット分析を用いて、骨髄中の阻害が、固形臓器は、一貫して収穫が容易でかつ試料収集及び処理中のリン酸化タンパク質の分解のためのより少ない機会を可能にする、凍結前に最小限または全く処理を必要とすることができる。免疫組織化学はまた、白血病の影響を受け、固形腫瘍または器官を評価するために使用することができる。
最後に、TKI（単数または複数）の治療効果は、白血病同所性異種移植片モデルにおいて決定される。これらの研究のために、治療開始のタイミングは、疾患が多かれ少なかれ確立されるように変えることができる。治療は、初期の研究のために移植した直後に開始することが、その後の重要な病気の重荷がより密接な診断治療モデルを近似するために検出されるまで、その後の研究で遅れる可能。理想的には、これらの動物モデルはまた、疾患負担の非侵襲的測定のための能力を有する。私たちは、ホタルルシファーの導入のための方法を最適化していますアーゼ遺伝子疾患の発症および進行と骨髄および固形臓器における疾患負荷の評価の非侵襲的、縦断的解析を可能にする、ウイルス様粒子を用いた白血病細胞系に変換する。このアプローチには重大な、ポリクローナル細胞株の使用に関連したルシフェラーゼ発現の白血病の発症のばらつきを防止するモノクローナルルシフェラーゼタグ付き細胞株の使用であり、TKI 8での治療とは無関係である。
まとめると、これらの手順は、単一のTKIの評価のために、または複数のTKIの直接比較し、ランク付けのために使用することができる。ここに提示プロトコルはTKI類の開発に集中しながら、これらの方法は、他のターゲットに適合させることができ、アッセイ開発のための考慮事項が記載されている。したがって、この戦略は、より広く、急性白血病の治療のための、分子標的薬の前臨床評価にも適用可能である。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿は、急性白血病の治療における新規チロシンキナーゼ阻害剤の評価のための効果的な戦略について説明します。このアプローチを用いて、生化学的及び抗白血病活性は、 インビトロでの細胞ベースアッセイにおいて最初に評価し、次いで、インビボで異種移植片モデルにおいてれる。イムノブロット分析は、正常のTKIによる治療後の白血病細胞における標的チロシンキ…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
in vivoイメージングコロラドがんセンターの大学のIVIS共有リソース（助成金P30-CA046934でサポートされている）を用いて行った。フローサイトメトリーは、コロラド大学がんセンター（助成P30CA046934でサポートされている）、フローサイトメトリー共有リソースで実施した。この作品は、国立衛生研究所（DKGへRO1CA137078）によって部分的にサポートされていました。 ABLSは米国小児科学会、アメリカ小児科学会、母子保健と人間開発のユニスケネディシュライバー国立研究所（K12-HD000850）からの補助金によって支え小児科学者育成プログラムのフェローである。
Materials
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
Referenzen
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