Multiplexé fluorescent puce à ADN pour salivaire humaine analyse des protéines en utilisant un polymère microsphères et faisceaux de fibres optiques
Summary
Nous décrivons une procédure pour le profilage de protéines salivaires utilisant multiplexés puces à anticorps à base de microsphères. Les anticorps monoclonaux ont été liés par covalence à 4,5 um microsphères de polymère de colorants fluorescents codé en utilisant la chimie du carbodiimide. Les microsphères modifiées ont été déposés dans des micropuits à fibres optiques pour mesurer les niveaux de protéine dans la salive en utilisant des dosages immunologiques par fluorescence en sandwich.
Abstract
Nous décrivons ici un protocole pour la mesure simultanée de six protéines de la salive à l'aide d'une base de microsphères puce à anticorps fibre optique. La technique d'immuno-matrice employée combine les avantages de base de microsphères en suspension tableau fabrication à l'utilisation de la microscopie à fluorescence. Comme décrit dans le protocole vidéo, disponibles dans le commerce microsphères de polymère de 4,5 um ont été codés en sept types différents, qui se différencient par la concentration de deux colorants fluorescents physiquement piégés à l'intérieur des microsphères. Les microsphères codées contenant des groupes carboxyle de surface ont été modifiées avec des anticorps monoclonaux de capture à travers EDC / NHS couplage de la chimie. Pour assembler la puce à protéines, les différents types de microsphères codées et fonctionnalisées ont été mélangés et déposés de manière aléatoire dans les micropuits 4,5 um, qui ont été gravées chimiquement à l'extrémité proximale d'un faisceau de fibres optiques. Le faisceau de fibres optiques a été utilisé à la fois comme support et pour l'imagerie de la microspheres. Une fois assemblée, la puce à ADN a été utilisée pour capturer des protéines dans le surnageant de la salive recueillie à partir de la clinique. La détection a été basé sur un dosage immunologique de type sandwich utilisant un mélange d'anticorps de détection biotinylés pour différentes substances à analyser avec une sonde fluorescente conjuguée à la streptavidine, R-phycoérythrine. La puce a été imagée par microscopie de fluorescence en trois canaux différents, deux pour l'enregistrement de la microsphère et une pour le signal de test. Les micrographies de fluorescence ont été ensuite décodées et analysées à l'aide d'un algorithme maison dans MATLAB.
Introduction
Depuis la première puce à ADN rapporté par Mark Schena et ses collègues dans le milieu des années 1990, ce puissant outil a été utilisé dans de nombreux domaines de la recherche biologique 1. Microréseaux d'anticorps capables de détecter simultanément de multiples protéines dans des fluides de diagnostic, tels que le sang, ont des applications importantes dans les diagnostics cliniques et des biomarqueurs de dépistage 2-10. Salive, contenant un grand nombre des mêmes analytes que le sang, a été considéré comme une alternative préférable au sang, car la collecte de salive est sûre, non invasive, et peut être effectué par le personnel médical peu formés 11-13. Actuellement, l'analyse des protéines multiplexé en utilisant des échantillons de salive est limitée par plusieurs facteurs importants, y compris la faible concentration de l'analyte cible 14 et la large gamme de concentrations différentes de marqueurs biologiques 15.
.Ici, nous démontrons l'analyse de six protéines: facteur endothélial vasculaire de croissance humaine (VEGF), la protéine induite par l'interféron-gamma 10 (IP-10), interleukine-8 (IL-8), facteur de croissance épidermique (EGF), la matrice métallopeptidase 9 (MMP-9), et l'interleukine-1 bêta (IL-1β) . Les performances du procédé a d'abord été vérifié à l'aide de solutions standard d'analyte constituant les protéines recombinantes et d'un tampon de blocage. Échantillons de salive réels recueillies auprès de patients de différentes maladies respiratoires chroniques ainsi que des contrôles sains ont également été testés avec des performances satisfaisantes. Le protocole devrait être applicable à d'autres analytes de protéines et d'autres essais à base de microsphères. Cette plate-forme offre des avantages considérables dans le domaine de chimie analytique, car elle permet l'analyse simultanée rapide, précis et reproductible de faibles concentrations de plusieurs protéines avec une large gamme dynamique, interactions non spécifiques minimales, la consommation réduite de l'échantillon, et à faible coût par rapport à un analogue Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Les chercheurs devraient accorder une attention supplémentaire pour les étapes suivantes: pour une meilleure précision de décodage, il est nécessaire de vérifier les microsphères ont été suspendus de manière homogène dans toutes les étapes de lavage et incubation pendant la procédure microsphères de codage. En outre, les microsphères doivent être codées à l'abri de la lumière à travers toute l'expérience. À la suite des procédures de codage et de stockage appropriées, nous avons constaté…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of de santé (subvention 08UDE017788-05). EBP reconnaît également le soutien de la Fondation Espagnole pour la Science et la Technologie (FECYT). Les auteurs remercient Shonda T. Gaylord et Pratyusha Mogalisetti pour la lecture critique du manuscrit.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
Referenzen
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. . Protein Microarray. , (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R. Devices to drool for. Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R. Ordered nanowell arrays. Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).
- Schena, M. . Protein Microarrays. , (2005).
