Procédure à suivre pour le développement de la multi-profondeur circulaire transversale endothélialisées microcanaux-on-a-chip

Summary

Une plate-forme microcanaux-on-a-chip a été développé par la combinaison de la technique de photolithographie reflowable de résine photosensible, lithographie douce, et la microfluidique. La plate-forme de micro-canaux endothélialisée imite la géométrie en trois dimensions (3D) des microvaisseaux in vivo, fonctionne sous débit de perfusion continue contrôlée, permet l'imagerie de haute qualité et en temps réel et peut être appliqué pour la recherche microvasculaire.

Abstract

Des efforts ont été concentrés sur le développement des essais in vitro pour l'étude des micro-vaisseaux parce que in vivo les études animales sont plus chronophage, coûteux, et l'observation et la quantification sont très difficiles. Cependant, classique dans des essais in vitro microvaisseaux ont des limites lorsqu'il s'agit de représenter in vivo microvaisseaux par rapport à la géométrie en trois dimensions (3D) et fournir un flux continu de fluide. En utilisant une combinaison de la technique de photolithographie reflowable de résine photosensible, lithographie douce, et microfluidique, nous avons développé une multi-profondeur endothélialisées transversales circulaires microcanaux-on-a-chip, qui imite la géométrie 3D in vivo microvaisseaux et fonctionne sous perfusion continue contrôlée écoulement. Une résine photosensible refusionnable positif a été utilisé pour fabriquer un moule maître à un réseau de microcanaux de section transversale semi-circulaire. Par l'alignement et le collage des deux (PDMS) microcanaux polydiméthylsiloxane replicated du moule maître, un réseau de micro-canal cylindrique a été créé. Les diamètres des microcanaux peuvent être bien contrôlés. De plus, la veine ombilicale cellules endothéliales humaines primaires (HUVEC) ensemencées à l'intérieur de la puce ont montré que les cellules alignées de la surface intérieure des micro-canaux sous perfusion contrôlée durant pendant une période de temps entre 4 jours à 2 semaines.

Introduction

Microvaisseaux, comme une partie du système de circulation, la médiation des interactions entre le sang et les tissus, soutenir les activités métaboliques, définir microenvironnement tissulaire et jouent un rôle essentiel dans de nombreuses conditions pathologiques et de santé. Récapitulation des microvaisseaux fonctionnelles in vitro pourrait fournir une plate-forme pour l'étude des phénomènes vasculaires complexes. Cependant, classique dans des essais microvaisseaux in vitro, tels que les tests endothéliales de cellules de migration, des tests de formation de tubes endothéliaux et des analyses d'anneau aortique chez le rat et la souris, sont incapables de recréer in vivo microvaisseaux par rapport à trois dimensions géométrie (3D) et le contrôle de flux continu ^1-8. Les études de microvaisseaux utilisant des modèles animaux et in vivo, comme test cornée de l'angiogenèse, essai d'angiogenèse de la membrane chorio poussin, et le dosage de Matrigel, sont plus de temps, un coût élevé, difficile en ce qui concerne l'observation et quantifications, etsoulever des questions éthiques ^{1, 9-13.}

Les progrès de la microfabrication et technologies de puces microfluidiques ont permis à une variété de points de vue en sciences biomédicales tout en réduisant les coûts d'expérimentation élevés et la complexité associés aux animaux et in vivo études ^14, tels que les conditions biologiques contrôlées facilement et solidement et des environnements fluides dynamiques, qui n'auraient pas été possible avec les techniques conventionnelles macroscopique.

Ici, nous présentons une approche pour construire un endothélialisée microcanaux-on-a-chip qui imite la géométrie 3D in vivo microvaisseaux et fonctionne sous débit de perfusion continue contrôlée en utilisant la combinaison de la technique de photolithographie reflowable de résine photosensible, lithographie douce, et la microfluidique.

Protocol

1. Photolithographie Fabrication de Photoresist moule maître Le protocole suivant montre le processus pour fabriquer des microcanaux avec des diamètres compris entre 30-60 um. Pour obtenir un micro-canal avec un diamètre plus faible (inférieure à 30 pm), un seul dépôt par centrifugation de résine photosensible est nécessaire. Transférer la résine photosensible de refusion du réfrigérateur à 4 ° C à la salle blanche 24 heures avant de l'utiliser et de le laisser…

Representative Results

Notre méthode pour fabriquer le réseau de microcanaux à plusieurs profondeur imite les géométries 3D complexes in vivo des microvaisseaux, dans lequel les micro-canaux ont des sections transversales arrondies 15. En outre, les diamètres des parents canaux de dérivation et les canaux de fille d'environ obéissent à la loi de Murray pour le maintien de l'écoulement du fluide à un niveau requis de sorte que la résistance globale du canal est faible et les vitesses d'écoulement so…

Discussion

1. Maître fabrication de moule

L'un des principes directeurs pour la conception et la morphométrie vasculaire est connue comme la loi de Murray ^16, qui stipule que la distribution de diamètre des vaisseaux dans tout le réseau est régi par des considérations d'énergie minimale. Il indique également que le cube des diamètres d'un vaisseau mère à une bifurcation est égale à la somme des cubes des diamètres des vaisseaux fille ( <img alt="Équation 1" fo:c…

Materials

Reagent/Material
Reflow Photoresist	AZ Electronic Materials	AZP4620
Developer	AZ Electronic Materials	AZ 400K
PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
MCDB 131 Culture Medium	Invitrogen	10372-019
NacBlue Nuclei Staining	Invitrogen	H1399
PKH Red Stain	Sigma	MINI26 and PKH26GL
Fibronectin	Gibco	PHE0023
L-Glutamine	Sigma	G7513
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14040-133
HEPES Buffered Saline Solution	Lonza	CC-5024
Trypsin/EDTA	Invitrogen	25300-062
Trypsin Neutralizing Solution	Lonza	CC-5002
PDMS Curing Agent	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Lonza	CC-2517
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-501F
Diluent C	Sigma	CGLDIL
Hoechst33342	Invitrogen, Molecular Probes	R37605
Dextran	Sigma	95771
3.5% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	15710-S
Equipment
Spinner	Laurell Technologies Corporation	WS-400BZ-6NPP/LITE
Desiccator	BelArt Products	999320237
Inverted Microscope	Nikon	Eclipse Ti
Syringe Pump System	Harvard Apparatus	PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood	Thermo Scientific	1300 Series A2
Planetary Centrifugal Mixer	Thinky	ARE-310
Isotemp Oven	Fisher Scientific	13-246-516GAQ
Optical Microscope	Zeiss	Invertoskop 40C
Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Hotplate	Barnstead/Thermolyne Cimarec	SP131635
Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 510