خلايا الثدييات إضاءة الحيوية مستقل للمراقبة المستمرة وريال مدريد في الوقت السمسة
Summary
خلايا الثدييات التعبير عن الجينات البكتيرية تلألؤ بيولوجي كاسيت (<em> لوكس</em>) إنتاج الضوء بشكل مستقل. وقد أظهرت ديناميات إضاءة الحيوية الناتجة عند التعرض للمواد الكيميائية لتعكس آثار العلاج على النمو الخلوي والتمثيل الغذائي، مما يجعل هذه الخلايا على والمستمر، في الوقت الحقيقي أداة فحص السمية الرخيصة التي يمكن بسهولة أن تتكيف لأتمتة عالية الإنتاجية.
Abstract
وقد استخدمت الثدييات الخلية التي يوجد مقرها في فحوصات المختبر على نطاق واسع كبدائل للالتجارب على الحيوانات لدراسات السمية ولكن كانت محدودة بسبب التكاليف النقدية والزمنية عالية من إعداد العينات الموازية التي استلزم نظرا لطبيعة المدمرة لليراعة طرق الفحص القائم على وسيفيراز . هذا الفيديو يصف استخدام خلايا الثدييات إضاءة الحيوية بشكل مستقل، والتي لا تتطلب إضافة المدمرة للركيزة وسيفيرين، كطريقة غير مكلفة وسطحية لرصد آثار السامة للخلايا من مركب من الفائدة. خلايا الثدييات التعبير عن ثابت وتلألؤ بيولوجي البكتيرية كامل (luxCDABEfrp) كاسيت الجينات تنتج ذاتيا إشارة ضوئية أن قمم في 490 نانومتر دون إضافة ركيزة وسيفيرين مكلفة وربما التدخل، الإثارة من مصدر طاقة خارجي، أو تدمير العينة التي هي تقليديا أجريت أثناء إجراء التصوير الضوئيق. هذا الاستقلال من مؤثر خارجي يضع عبئا على الحفاظ على رد فعل إضاءة الحيوية فقط على الخلية، وهذا يعني أن الإشارة الناتجة هي فقط اكتشفت أثناء عملية الأيض نشطة. هذه الخاصية تجعل لوكس، معربا عن خط الخلية مرشح ممتاز لاستخدامها بوصفها biosentinel من الآثار السامة للخلايا وذلك لأن التغيرات في إنتاج إضاءة الحيوية التي تدل على آثار سلبية على النمو الخلوي والتمثيل الغذائي. وبالمثل، فإن طبيعة الحكم الذاتي وعدم تدمير عينة تصاريح التصوير المتكرر لنفس العينة في الوقت الحقيقي طوال فترة التعرض السموم، ويمكن أن يؤديها عبر عينات متعددة باستخدام معدات التصوير القائمة بطريقة آلية.
Introduction
في الولايات المتحدة، والمستحضرات الصيدلانية وغيرها من المنتجات المعدة للاستهلاك البشري تتطلب تقييم واسعة النطاق قبل الموافقة عليها لاستخدام المستهلك من قبل إدارة الغذاء والدواء. يتم وضع العبء المالي لتنفيذ هذا الاختبار على مطور 1، مما يزيد بشكل كبير من تكلفة تطوير مجمع جديد، وبالتالي يترجم إلى زيادة تكلفة بالنسبة للمستهلكين. في حين أن الكثير تقليديا من هذا الفحص قد تستغل الموضوعات الحيوان ليكون بمثابة وكلاء للالمضيفين الإنسان، وقد ثبت أن هذا عبئا ماليا كبيرا، مع ما يقدر بنحو 2.8 مليار دولار تنفق سنويا على ADME / توكس (الامتزاز، والتوزيع، والتمثيل الغذائي، وإفراز، وسمية ) فحص وحده 2 و أدلة متزايدة تشير إلى أن النماذج الحيوانية لا يمكن التنبؤ بشكل موثوق الردود السمية الإنسان 3. ولذلك، في المختبر الإنسان الاختبارات القائمة على ثقافة الخلية وقد اكتسب شعبية على مدى العقدين الماضيين لما له من أقل نسبياالتكلفة، وأعلى إنتاجية، وتمثيل أفضل من التوافر البيولوجي البشرية وعلم السموم 4. الأساليب الحالية الخلية المستندة إلى ثقافة الفحص السمية تستخدم نقاط النهاية مختلفة، مثل قياس مستويات ATP، وفحص نشاط الانزيمات حشوية المتاحة التطور الطبيعي، التي تحقق سلامة الغشاء الخلوي، أو تتبع مستوى النشاط الميتوكوندريا، لتقييم الجدوى الخلوية 5 ، 6. ومع ذلك، بغض النظر عن نقطة النهاية اختيار، وهذه الأساليب تتطلب كل الدمار من قبل عينة يمكن أن تؤخذ القياسات، وبالتالي إنتاج البيانات فقط عند نقطة زمنية واحدة. ونتيجة لذلك، فإن أعدادا كبيرة من العينات تحتاج إلى أن تكون مستعدة وتعامل بشكل متواز لدراسات السمية الحركية الأساسية، مضيفا مرة أخرى إلى التكلفة والعمالة المطلوبة لتطوير مجمع جديد. بدلا من ذلك، استخدام المقايسات يفرز وسيفيراز مثل Gaussia وسيفيراز 7، 8 Vargula وسيفيراز، وMetridia وسيفيراز 9وقد تم تطوير هذا يزيل الحاجة إلى تحلل الخلايا وتتطلب جزء من وسائل الإعلام لقياس نقطة النهاية، ولكن هذه لا تزال محدودة لأخذ العينات في نقاط زمنية محددة سلفا، وتتطلب أيضا إضافة الخارجية ركائز ضوء تفعيل.
لتجنب يضر المطلوبة تدمير عينة وكذلك للقضاء على تكلفة ركائز، فقد تم تصميم خط الخلية البشرية التي تعبر عن تلألؤ بيولوجي البكتيرية كامل (لوكس) كاسيت الجين (luxCDABEfrp) للسماح للرصد المستمر للخلايا الحية مشابه إلى فلوري صبغ القائمة على التصوير الخلية الحية، ولكن من دون إجراءات إضافية التحقيق الفوتون تفعيل والمجهرية. هذا الخط خلية قادرة على انتاج جوهري إشارة ضوئية لاستمرار الكشف المباشر دون الحاجة إلى مؤثر خارجي، وبالتالي تجنب تدمير العينة. ميكانيكيا، في إشارة إضاءة الحيوية المتولدة من هذه الخلايا يؤديو عندما يحفز انزيم وسيفيراز luxAB-شكلت أكسدة من ألدهيد الدهنية طويلة السلسلة (توليفها ومجدد من المنتجات الجينات luxCDE استخدام ركائز داخلية المنشأ) في وجود انخفاض فيتامين بي الفوسفات (FMNH 2، التي يعاد تدويرها من FMN بواسطة الجينات فرب المنتج) والجزيئية الأكسجين 10. وبالتالي التعبير عن كاسيت لوكس في الخلية المضيفة تمكن الضوء ليتم إنتاجها والكشف دون تدمير الخلايا أو الخارجية بالإضافة الركيزة. وبالمثل، فإن التفاعل بين الجينات لوكس وFMN التطور الطبيعي المتاحة، وO 2 cosubstrates، وشرط لصيانة بيئة التي يمكن أن تدعم تحويل FMN إلى FMNH 2، ويضمن أن الإشارة إضاءة الحيوية الناتجة لا يمكن إلا أن يتم الكشف عن الكائنات ، خلايا نشطة عملية الأيض.
سبق لها أن تستغل هذه المتطلبات لإثبات أن لوكس BASإد إضاءة الحيوية خرج يرتبط بقوة مع الخلوية حجم السكان 11 وأن التعرض مركب سام يضعف الإنتاج autobioluminescent بطريقة الاستجابة للجرعة 12. هنا نستخدم autobioluminescent الكلى الجنينية البشرية تتميز سابقا (HEK293) خط الخلية 11 للتدليل على فحص السمية الآلي من مضاد حيوي من عائلة بليوميسين مع الحمض النووي المعروف النشاط ضارا وذلك سبيل المثال ممثل للتحقق من صحة تطبيق خلايا الثدييات autobioluminescent لاختبار السمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوضح هذه الطريقة على استخدام خلايا الثدييات إضاءة الحيوية بشكل مستقل كما في المختبر فحص السمية الخلوية التي تتيح فحص الخلايا الحية التي يتعين رصدها بشكل مستمر على مدى حياتهم. هذا البروتوكول هو مرن، ويمكن تعديلها لاستيعاب ظروف تجريبية محددة كما هو مطلوب. على سبي…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتم دعم هذه الجهود البحثية من قبل شعبة المؤسسة الوطنية للعلوم النقل (CBET) نظم تحت أرقام جائزة CBET-0853780-1159344 وCBET والمعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية (معهد علوم الصحة البيئية) الكيميائية، الهندسة الحيوية، البيئة، و تحت الجائزة عدد 1R43ES022567-01، والمعهد الوطني للسرطان، وبرنامج التصوير السرطان تحت الجائزة عدد CA127745-01. تم الحصول على صك لومينا IVIS المستخدمة في هذا العمل من دفاع الجيش الأجهزة برنامج البحوث جامعة في الولايات المتحدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comment |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
Referenzen
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved?. FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441 (2010).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).
