בידוד ואפיון פונקציונלי של אדם חדרית שריר לב מדוגמאות כירורגי טריות

Summary

ידע הנוכחי על הבסיס התאי של מחלות לב בעיקר מסתמך על מחקרים במודלים של בעלי חיים. כאן אנו מתארים ולאמת שיטה חדשה להשיג cardiomyocytes קיימא אחת מדגימות ניתוחיות קטנות של שריר הלב חדרית האנושי. myocytes חדרית האנושי יכול לשמש למחקרי אלקטרו ובדיקות סמים.

Abstract

שריר לב מלב חולה חשופים לתהליכי שיפוץ המורכבים של שינויים במבנה תא, צימוד התכווצות עירור וזרמי יונים בממברנה. שינויים אלה עשויים להיות אחראים לעליית arrhythmogenic שינויי ההתכווצות שמוביל לחוסר תפקוד סיסטולי ודיאסטולי בחולי לב בסיכון ו. עם זאת, רוב המידע על השינויים של תפקוד myocyte במחלות לב הגיע ממודלים של בעלי חיים.

כאן אנו מתארים ולאמת פרוטוקול לבודד myocytes קיימא מדגימות ניתוחיות קטנות של שריר הלב חדרית מחולים שעברו ניתוחי לב. הפרוטוקול מתואר בפירוט. מדידות סידן אלקטרו ותאיות הם דיווחו להוכיח את ההיתכנות של מספר מדידות תא בודדים בשריר הלב של חדר של אדם שנלקח בשיטה זו.

הפרוטוקול דיווח שהואמחדש יכול להיות שימושי לחקירות עתידיות של הבסיס התאי ומולקולרי של שינויים תפקודיים של הלב האנושי בנוכחות מחלות לב שונות. יתר על כן, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לזהות מטרות טיפוליות חדשניות ברמה תאית וכדי לבדוק את האפקטיביות של תרכובות חדשות בשריר לב אנושי, עם ערך translational ישיר.

Introduction

Dissection של מאפייני אלקטרו של שריר הלב התקדם במידה ניכרת לאחר הפיתוח של טכניקות לבידוד myocyte לב אחד. פיתוחים אחרונים בהבנה של לב עירור התכווצות צימוד (EC-צימוד) גם כבר מתאפשרים על ידי היכולת של בידוד שריר לב יחיד קיימא ששומרים על כל המאפיינים הפיסיולוגיים של הרקמות שלמות. שיטות מהדק תיקון מועסקות באופן שיגרתי כדי ללמוד את התפקיד ואפנון תרופתי של זרמי יון sarcolemmal לב. הקלטות של דינמיקת סידן תוך תאי עם ^{2 +} צבעים רגישים Ca מבוצעות גם באופן קבוע על myocytes לב אחת ממגוון רחב של דגמים בריאים וחולים, המספקות נתונים חיוניים על הפיסיולוגיה של EC-צימוד כמו גם על השינויים פתולוגיים של תאיים Ca ^{2 +} הומאוסטזיס מוביל לליקוי מכאני וניטל arrhythmogenic מוגבר במחלות לב. Information ממחקרים אלה הוא קריטי להבנת השפעות אלקטרו מכניות של תרופות במסגרת הקלינית. עם זאת, יש הבדלים מסוימים במיני זרמי הטרנסממברני ובחלבוני EC-הצימוד כי חשבון עבור תכונות מסוימות של פוטנציאל פעולת לב ומכניקת לב. וכך, בעוד מחקרים של myocytes מבודד מיונקים שאינם בני אדם שהובהרו מאפייני biophysical ותפקידים פיסיולוגיים של ערוצים ספציפיים הטרנסממברני יון וחלבונים EC-צימוד, הם לא בהכרח לספק מודלים רלוונטיים של myocytes לב האנושי. בידוד של myocytes קיימא משריר הלב אנושי הוא חיוני ולכן כדי להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות לב ולאמת גישות טיפוליות חדשניות.

רקמת פרוזדורי אדם זמינה כנספחי פרוזדורים לעתים קרובות הושלכו במהלך הליכים כירורגיים. מחקרים כמותיים ראשוניים של פוטנציאל למבוגרים פעולה אנושי לבבית ומ"ק היוניrrents מועסק תאי פרוזדורי אנזימים מבודדים ^1-4. הקלטות של פוטנציאל פעולה או זרמים מתאי חדרית בודדים מבוגרים אנושיים דווחו לאחר מכן ^3,5-10. רוב המחקרים הללו השתמשו בתאים המתקבלים מלב explanted ומנוצלים גם זלוף collagenase של קטע לב כלילית או חשיפה של כמויות גדולות היחסי של רקמה שנכרתה לCollagenase להשיג תאים מבודדים. מחקרים אלה אפשרו אפיון מפורט של מספר זרמי יון הטרנסממברני משריר לב חדרית אדם מלב בריא ומחולים עם אי ספיקת לב סופנית. הקלטות של סוג L-Ca ^{2 +} נוכחית (אני _CA-L) ^5-7, נוכחית חולף אשלגן החוצה (אני _ל) ^8, פנימה הנוכחי אשלגן מיישר (אני _κ1) ^8, המרכיבים השונים של זרם אשלגן rectifier מתעכב (אני _κ ) ⁹ כבר דיווחו. התקדמות וזיקוק שלהליך הבידוד ^10, אפשר אפיון ברור של הבסיס היוני של פוטנציאל arrhythmogenic גדל באי ספיקת לב סופנית, הכולל הארכת פוטנציאל פעולת ^11, עיכב אחרי depolarizations ¹² ועלה ¹³ הנוכחיים מצחיקים שהוביל לשלילת קוטביות דיאסטולי ופעימות מוקדמות.

myocytes לב למבוגרים בדרך כלל מבודד מבעלי חיים קטנים על ידי זלוף המדרדר של הלב השלם עם תערובות אנזים שונות, טכניקה שמייצרת תשואות גבוהות של ² תאים ⁺ סובלניים Ca ^14. בידוד של myocytes לב מרסיסים של רקמה הוא מטבעם פחות מוצלח כנראה בגלל הגישה המוגבלת של אנזימים לmyocytes הבודד בהשוואה לזה שהושג ע"י טפטוף של עורקים הכליליים. בגלל הזמינות מוגבלת מאוד של לב תורם שאינו בשימוש, הדרך המעשית היחידה להשיג תאי חדרית אדם נורמלים על בסיס קבוע היא על ידי digestio האנזימטיתn של שברי הרקמה קטנים מאוד לעתים קרובות נכרת במהלך ניתוחים אלקטיביים. מודל המחלה האנושי היחיד שהתאפיין ביסודיות ברמת תא הוא אי ספיקת לב הטרמינל, בשל הנגישות ללב מושתל. עם זאת, אי ספיקת לב מסוף מתרחשת במיעוט של חולים, ולעתים קרובות כרוך במסלול משותף של שיפוץ חמור של תאי שריר הלב, שהיא עצמאית יחסית של הגורם הבסיסי ^15. היכולת להעריך את תפקוד שריר לב אחת מחולים בשלב שאינו כושל קודם של מחלה היא קריטית כדי להבין את הפתופיזיולוגיה מסוימת של תנאים בירושה או רכשו שונים. קרדיומיופתיה hypertrophic (HCM) היא דוגמא מאלפת. HCM הוא נפוץ (1/500 יחידים) מצב לב בירושה מאופיין היפרטרופיה לבבית, גדל שינויי סיכון והתכווצות arrhythmogenic בשל חסימה בדרכי יצוא ותפקוד הדיאסטולי ^16. שריר לב מלב HCM undergo תהליכי שיפוץ מורכבים של שינויים במבנה תא (היפרטרופיה, אנדרלמוסית myofibrillar) ו-EC-צימוד ^17. עם זאת, רוב המידע של חוסר תפקוד myocyte בHCM הגיע ממודלים של בעלי חיים מהונדסים. שכן רק מיעוט של חולי HCM מתפתח לכיוון אי ספיקת לב סופנית ודורש השתלת לב, לב HCM זמין לעתים רחוקות מאוד לבידוד תא עם שיטות סטנדרטיות. עם זאת, לפחות 30% מחולי HCM לפתח סימפטומים חסימתית עקב זרימת דם בדרכי יצוא שינוי היפרטרופיה במחיצה מסיבית במהלך התכווצות (HCM) ^18. האופציה הטיפולית זמינה היעילה ביותר להקלה על החסימה בHCM היא myectomy מחיצה כירורגית: בהליך כירורגים זה, חלק בגודל משתנה של עליונה מחיצה הוסר על ידי גישה של אב העורקים טראנס. חלק זה של מחיצת אף יתר על לכן הוא זמין לבידוד תא מהרקמה הטרי.

שיטה לבידוד של ventricula אדםr myocytes מדגימות בודדות, קטנות transvenous endomyocardial ביופסיה כבר פותח בעבר ופורסם ^19. אנחנו יישמנו שיטה לבודד myocytes במחיצה אחת מדגימות שריר הלב חדרית מחולים שעברו ניתוח לב, לרבות חולים עם HCM עוברים myectomy וחולים שעברו הליכים להחלפת שסתום במחיצה. בנוסף לתיאור מפורט של פרוטוקול הבידוד, אלקטרו הנציג וCa ^{2 +} הקרינה מדידות מוצגות, הוכחת הכדאיות של myocytes חדרית האדם המבודד ואת הכדאיות של מהדק התיקון וCa ^{2 +} מחקרים תאיים.

Protocol

פרוטוקולי הניסוי ברקמות אנושיות אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת Careggi-החולים (2006 / 0,024,713; מאי מחודש 2009). כל מטופל נתן הסכמה מדעת בכתב. 1. פתרונות וציוד הכנה פתרונות מתוארים בטבלה 1. ?…

Representative Results

השיטה שתוארה לעיל הועסקה לאפיין את הליקויים תפקודיים של שריר לב מבודד ממחיצת interventricular של חולים עם קרדיומיופתיה hypertrophic (HCM) שעברו ניתוח myectomy, בהשוואה לחולים שאינם כושלים שאינו hypertrophic כירורגית 21. התוצאות הכלולות בסעיף זה נובעות מהעבודה ש21 ומוצגות כאן כדוגמ…

Discussion

שתארנו ומאומתים שיטה לבודד myocytes קיימא מדגימות כירורגית של שריר הלב חדרית האנושי. החל מפרוטוקולים שתוארו קודם לכן, ששימש בהצלחה לתאים מבודדים מדגימות ניתוחיות פרוזדורים, הטכניקה כדי לאפשר הפרדת myocytes קיימא אחת משריר הלב של חדר חולה פותחה ומכויל. דיווחים מוקדמים הראו ?…

Materials

Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4 * 7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Fig 1 C-D and in Fig.7. We can provide further details if requested
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods