Un Injury Modello alcali-burn di neovascolarizzazione corneale nel mouse
Summary
Neovascolarizzazione (NV) della cornea può complicare molteplici patologie visive. Utilizzando un modello di lesione alcali-un'ustione controllata, un livello quantificabile di NV corneale può essere prodotta per lo studio meccanicistico di NV corneale e valutazione di potenziali terapie per i disordini neovascolare.
Abstract
In condizioni normali, la cornea è avascolare, e questa trasparenza è essenziale per mantenere una buona acuità visiva. Neovascolarizzazione (NV), della cornea, che può essere causata da traumi, cheratoplastica o malattie infettive, rompe il cosiddetto 'privilegio angiogenica' della cornea e costituisce la base di molteplici patologie visive che possono anche portare alla cecità. Anche se ci sono diverse opzioni terapeutiche disponibili, la necessità medica fondamentale presentata da patologie corneali neovascolare rimane insoddisfatto. Per sviluppare sicuri, efficaci e mirate terapie, è necessario un modello affidabile di NV corneale e intervento farmacologico. Qui, descriviamo un modello di neovascolarizzazione corneale lesioni alcali-burn nel topo. Questo protocollo fornisce un metodo per l'applicazione di una lesione alcali un'ustione controllata alla cornea, la somministrazione di un composto di interesse farmacologico e la visualizzazione del risultato. Questo metodo potrebbe rivelarsi strumentazioneTal per studiare i meccanismi e le opportunità di intervento in NV corneale e altri disturbi neovascolare.
Introduction
Cecità corneale è la quarta causa più comune di cecità, responsabile di circa il 4% di tutti i casi 1. Neovascolarizzazione corneale (NV) svolge un ruolo significativo in molte di queste patologie, tra cui cheratite erpetica (la causa infettiva di cecità in Occidente) e il tracoma (la principale causa di cecità contagiosa in tutto il mondo) 2. Terapie attuali includono steroidi, farmaci anti-infiammatori non steroidei (FANS), terapie anti-VEGF, e ciclosporina A, nonché tecniche chirurgiche convenzionali o laser 3. Tuttavia, la natura gravemente invalidante delle patologie NV basato corneali, la scarsità di strutture chirurgiche in grado di trattare NV corneale, e la mancanza di un'opzione farmacologica fortemente l'esecuzione ha condotto una tavola rotonda di esperti recente a concludere che, nonostante le terapie esistenti, la necessità medica fondamentale presentano tali patologie rimane insoddisfatta 4.
La cornea umanasi compone di 5 strati, 3 strati cellulari (epiteliale, stromali ed endoteliali) e 2 di interfaccia (membrana di Bowman e la membrana Descemet). Esso funziona come barriera meccanica e la superficie di rifrazione per l'occhio. La sua natura trasparente è la conseguenza di un delicato equilibrio dei suoi componenti ed è solidale alla propria funzione 5. Normalmente avascolare, la cornea riceve il sangue da microvasi che corre lungo il bordo esterno che sono alimentati dalla ciliare e arterie oftalmiche. Corneale NV si verifica quando uno stimolo promuove l'angiogenesi di questi vasi permettendo loro di crescere verso il centro della cornea e limitano visione 6 così. Angiogenesi corneale comprende hemangiogenesis e linfoangiogenesi, che determinano la crescita interna dei vasi sanguigni e dei vasi linfatici dal porticato vascolare limbare verso il centro della cornea. Questo porta ad una ripartizione dei corneale "privilegio angiogenico", un aumento di opacità corneale e fibrosi, distruzione della cornea layers, ed edema 7. I trigger precise di NV corneale sono numerosi, che vanno da una risposta alle malattie infettive, come il tracoma ad uno stato indotto chimicamente causato medicine tradizionali, prodotti chimici industriali, o agenti di guerra anche chimici.
I meccanismi molecolari di questo processo non sono, ancora, completamente caratterizzati; tuttavia, sono stati identificati alcuni giocatori chiave. In condizioni normali la cornea possiede un unico 'privilegio angiogenica' mantenuto da un insieme ridondante di fattori anti-angiogenici (come solubile VEGF-R1) 8. Tuttavia, in risposta ad uno stimolo esterno (come una ferita), ci sarà un upregulation locale di fattori pro-angiogenici (ad esempio VEGF-A). Questo punte l'equilibrio di fattori pro-e anti-angiogenici che sta alla base privilegio angiogenico della cornea, e porta a hemangiogenesis, lymphangeogenesis, e l'infiammazione, provocando quindi la patologia corneale e persino la cecità 9.
<class p = "jove_content"> Data l'esigenza medica insoddisfatta di questa patologia altamente invalidante, è di interesse per il campo per avere un modello animale affidabile di NV corneale. Qui vi presentiamo un tale modello: controllato lesioni alcali-burn. Vari modelli eye-pregiudizio basati sull'utilizzo di anelli di carta da filtro sono stati utilizzati dal 1970 10. Nel 1989, un gruppo di oftalmologi Harvard Medical School caratterizzato un modello standard di una lesione corneale alcali-burn centrale nel coniglio basato su imbevendo un pezzo di carta da filtro circolare con idrossido di sodio (NaOH) e la sua applicazione alla cornea ad una specifica gamma di concentrazioni 11. Da allora, questa tecnica è stata adattata per l'uso nel 12-14 mouse. Recentemente, il laboratorio Wang ha studiato gli effetti terapeutici della istone deacetilasi (HDAC) SAHA nella patogenesi della NV cornea usando un mouse corneale alcali-burn modello di lesione 15. La metodologia del modello di lesione corneale alcali-burn del mouse qui presentato è stato costruitoprincipalmente sul lavoro prima di altre due carte 14,16.Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato qui si traduce in livelli riproducibili di hemangiogenesis, linfoangiogenesi, e l'infiammazione, che lo rende un sistema ideale per studiare questi tre processi (correlati). Mentre questo metodo produce NV corneale centralizzata, diversi metodi che sono stati sviluppati per causare più diretto NV, cioè la sutura della cornea 17 e impiantati fattore di crescita esprimendo pellet 18, potrebbe anche essere di interesse. Il nostro protocollo è stato progettato per l'…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati per l'aiuto del dottor Xinyu Li nella preparazione del manoscritto. SW è stato sostenuto da un fondo di avvio da Tulane University, del Presidente New Investigator Award Research Council dal UT Southwestern Medical Center, NIH di Grant EY021862, un premio sviluppo di carriera dalla ricerca per la prevenzione cecità fondazione, e un premio brillante Focus in degenerazione maculare senile Research .
Materials
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 18 Guage Needle | BD | 305918 | |
| 10 mL Syringe | BD | 306575 | |
| 25 Guage Needle | BD | 305916 | |
| Anti-F4/80 (rat anti-mouse) | AbD Serotech | MCA497RT | |
| Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) | Abcam | ab14917 | |
| Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) | BD | 553370 | |
| Anti-IgG Alexa488 (goat anti-rat) | Invitrogen | A11006 | |
| Anti-IgG Alexa594 (goat anti-rabbit) | Invitrogen | A11012 | |
| Camera | Tucsen | TCC 5.0 ICE | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DMSO | Sigma | D4540-1L | Caution: Mutagenic, Toxic |
| Forceps (Blunt), Iris | WPI | 15915 | |
| Forceps (Sharp), Dumont #4 | WPI | 500340 | |
| KCl | Fisher | P217-500 | |
| Ketamine Solution | MedVet | RXKETAMINE | Controlled substance, proper license required for use. |
| Light Source for Microscope | AmScope | LED-14M-YA | |
| Microscope (Stereo 7X-45X) | AmScope | SM-1B | |
| Mounting Medium, Vectashield | Vector | H-1000 | |
| NaCl | Fisher | S271-10 | |
| NaH2PO4 | Fisher | S397-500 | |
| NaOH | Fisher | S318-1 | Caution: Corrosive |
| Paraformaldehyde | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic | |
| Proparacaine Hydrochloride | Sigma | P4554-1G | |
| Scissors (5mm blade), Vanas | WPI | 14003 | |
| Goat Serum | MPBio | 92939249 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-6508 | |
| Xylazine Solution | MedVet | RXANASED-20 |
Referenzen
- Pascolini, D., Mariotti, S. Global estimates of visual impairment. Br. J. Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2010).
- Whitcher, J., Srinivasan, M., Upadhyay, M. Corneal Blindness: A Global Perspective. Bull. World Health Org. 79 (3), 214-221 (2003).
- Gupta, D., Illingworth, C. Treatments for corneal neovascularization: a review. Cornea. 30 (8), 927-938 (2011).
- Cursiefen, C., et al. Consensus statement on indications for anti-angiogenic therapy in the management of corneal diseases associated with neovascularisation: outcome of an expert roundtable. Br. J. Ophthalmol. 96 (1), 3-9 (2012).
- Delmonte, D., Kim, T. Anatomy and Physiology of the Cornea. J. Cataract Refract. Surg. 37 (3), 588-598 (2011).
- Cursiefen, C., Seitz, B., Dana, M. R., Streilein, J. W. Angiogenesis and lymphangiogenesis in the cornea. Pathogenesis, clinical implications and treatment options. Der Ophthalmologe. 100 (4), 292-229 (2003).
- Chang, J., Gabison, E., Kato, T., Azar, D. Corneal Neovascularization. Curr. Opin Ophthalmol. 12 (4), 242-249 (2001).
- Ambati, B., et al. Corneal Avascularity is due to Soluble VEGF Receptor-1. Nature. 443 (7114), 993-997 (2006).
- Cursiefen, C., et al. VEGF-A Stimulates Lymphangiogenesis and Hemangiogenesis in Inflammatory Neovascularization via Macrophage Recruitment. J. Clin. Invest. 113 (7), 1040-1050 (2004).
- Jiri, O. Paper Strips and Rings as Simple Tools for Standardization of Experimental Eye Injuries. Ophthal. Res. 1975 (7), 363-367 (2009).
- Ormerod, L., Abelson, M., Kenyon, K. Standard Models of Corneal Injury Using Alkali-Immersed Filter Discs Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30 (10), 2148-2153 (1989).
- Saika, S., et al. Therapeutic effects of adenoviral gene transfer of bone morphogenic protein-7 on a corneal alkali injury model in mice. Lab. Invest. 85 (4), 474-486 (2005).
- Ferrari, G., Bignami, F., Giacomini, C., Franchini, S., Rama, P. Safety and efficacy of topical infliximab in a mouse model of ocular surface scarring. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (3), 1680-1688 (2013).
- Sosne, G., Christopherson, P., Barrett, R., Fridman, R. Thymosin-beta4 modulates corneal matrix metalloproteinase levels and polymorphonuclear cell infiltration after alkali injury.Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46 (7), 2388-2395 (2005).
- Li, X., et al. Inhibition of Multiple Pathogenic Pathways by Histone Deacetylase Inhibitor SAHA in a Corneal Alkali-Burn Injury Model. Mol. Pharm. 10 (1), 307-318 (2013).
- Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmol. 86 (3), 322-328 (2008).
- Bucher, F., Parthasarathy, A., Bergua, A., Onderka, J., Regenfuß, B., Cursiefen, C., Bock, F. Topical Ranibizumab inhibits inflammatory corneal hem- and lymphangiogenesis. Acta Ophthalmol. , (2012).
- Hajrasouliha, A., Sadrai, Z., Chauhan, S., Dana, R. b-FGF induces corneal blood and lymphatic vessel growth in a spatially distinct pattern. Cornea. 31 (7), 804-809 (2012).
- Rogers, M., et al. The albino mutation of tyrosinase alters ocular angiogenic responsiveness. Angiogenesis. 16 (3), 639-646 (2013).
- Connor, K., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological. Nat. Protoc. 4 (11), 1565-1573 (2009).
