FIBS habilitadas no invasiva perfiles metabólicos

Summary

Se presenta una descripción de cómo calibrar Transferencia Förster Resonance Energy sensores biológicos integrados (FIBS) en el perfil metabólico situ. Los FIBS se pueden utilizar para medir los niveles intracelulares de metabolitos de forma no invasiva ayudando en el desarrollo de modelos metabólicos y cribado de alto rendimiento de las condiciones de bioprocesos.

Abstract

En la era de la biología computacional, nuevos sistemas experimentales de alto rendimiento son necesarios con el fin de poblar y refinar los modelos para que puedan ser validados para fines predictivos. Idealmente estos sistemas serían bajo volumen, que se opone a los análisis de muestreo y destructivas cuando los datos de curso de tiempo se han de obtener. Lo que se necesita es una herramienta de supervisión in situ en la que puede reportar la información necesaria en tiempo real y de forma no invasiva. Una opción interesante es el uso de lámparas fluorescentes, en sensores biológicos in vivo como reporteros de concentraciones intracelulares a base de proteínas. Una clase particular de in vivo biosensores que ha encontrado aplicaciones en la cuantificación metabolito se basa en Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) entre dos proteínas fluorescentes conectadas por un dominio de unión a ligando. FRET sensores biológicos integrados (FIBS) se producen de forma constitutiva dentro de la línea celular, que tienen tiempos de respuesta rápidos y su cha espectralrísticas cambios de acuerdo a la concentración del metabolito dentro de la célula. En este documento, se describe el método para la construcción de ovario de hámster chino (CHO) líneas celulares que expresan constitutivamente una FIBS para la glucosa y la glutamina y la calibración de los FIBS in vivo en cultivo celular por lotes con el fin de permitir que el futuro cuantificación de la concentración de metabolito intracelular. Los datos de fed-batch cultivos de células CHO demuestra que los FIBS fue capaz en cada caso para detectar el cambio resultante en la concentración intracelular. Uso de la señal fluorescente de los FIBS y la curva de calibración previamente construido, la concentración intracelular se determinó con precisión como se confirmó mediante un ensayo enzimático independiente.

Introduction

Monitoreo metabolito tiene diversas aplicaciones en el procesamiento biológico, incluyendo el desarrollo del proceso, los medios de comunicación y el diseño de alimentación, y la ingeniería metabólica. Varios métodos están disponibles para las mediciones de concentración a través de la utilización de ¹ enzimática, química ^2, o ensayos de unión ^3. Una opción interesante es el uso de lámparas fluorescentes, en sensores biológicos in vivo como reporteros de la concentración intracelular de metabolitos clave a base de proteínas. En los ensayos de volumen ultra bajo, la fluorescencia es una herramienta conveniente como la miniaturización realmente mejora la relación de ^{4,5-señal-ruido} y sensores basados ​​en proteínas puede ser codificado genéticamente el sentido de que no hay reactivos exógenos son necesarios para el análisis de metabolitos. Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) biosensores consisten en dos proteínas fluorescentes conectadas por un dominio de unión a ligando. FRET es una transferencia de energía no radiante de un donante fotoexcitado a un aceptor fluorescente molécula locat ed en estrecha proximidad (<100). La escisión ligando o unión provoca un cambio conformacional en el sensor, que, a su vez, induce un cambio en la proximidad de los fluoróforos, lo que lleva a un cambio en la eficiencia de FRET medido por el cambio en el espectro de emisión. Sensores biológicos FRET integrados (FIBS) se producen de forma constitutiva dentro de la línea celular y sus características espectrales cambian en función de la concentración del metabolito dentro de la célula. FIBS tienen tiempos de respuesta rápidos lo que es ideal para la toma de mediciones para los modelos dinámicos ^6. Aplicaciones anteriores incluyen el monitoreo individuales ^7-9 y múltiples ¹⁰ metabolitos y proporcionar datos sobre la distribución espacio-temporal ^11. FIBS se pueden crear en dos configuraciones: Apo-Max, donde la unión del ligando altera la proximidad de los fluoróforos bajada de transferencia de energía y Apo-Min, donde la unión del ligando trae los dos fluoróforos en contacto más estrecho (Figura 1).

_content "> En este trabajo, se presenta un protocolo para la construcción de ovario de hámster chino (CHO) líneas celulares que expresan constitutivamente una FIBS de un metabolito, glucosa o glutamina. Se establece una metodología para la calibración del sensor in vivo para permitir el futuro cuantitativa mediciones de la concentración de metabolito intracelular, tal como se presenta en la Figura 2. Sobre la base de esto, la concentración intracelular de glucosa o glutamina pueden determinarse en discontinuos alimentados cultivos de células CHO, al que se añadieron los dos nutrientes en altas concentraciones en-proceso. Los resultados demuestran que el uso de la señal fluorescente de los FIBS y la curva de calibración previamente construido, la predicción precisa de la concentración intracelular es posible, como se confirmó mediante un ensayo enzimático independiente. Este método ofrece ventajas sustanciales sobre tecnologías analíticas actuales, ya que no es invasiva y de bajo costo y rápido, dando una señal en tiempo real de los FIBS que pueden ser lunmonitoriza todo el cultivo.

Protocol

1. Línea Celular Revival y mantenimiento Revive células CHO en 9 ml de medio de CD-CHO suplementado con 8 mM de L-glutamina y ml / L de suplemento de hipoxantina 100x / timidina 10 (medio de crecimiento completo). Se centrifuga a 100 × g durante 5 min. Resuspender las células en 10 ml de medio de crecimiento completo fresco. Extraiga una muestra de 1 ml y determinar la concentración de células viables mediante microscopía óptica utilizando el método de exclusión del col…

Representative Results

Una visión general de la metodología se presenta en la Figura 2. En el trabajo presentado en este documento, las células CHO fueron transfectadas con el vector de FIBS y líneas celulares estables se seleccionaron a una presión de antibiótico de 400 mg / ml de zeocina. Por lo tanto, se crearon dos líneas celulares estables que expresan constitutivamente separados los sensores de glucosa y glutamina. Figura 1 representa las configuraciones de los dos biosensores utilizados en este …

Discussion

Los FIBS permiten in vivo y en la cuantificación in situ de moléculas clave, en este caso nutrientes limitantes del crecimiento, la eliminación de incertidumbres derivadas de temple y métodos de extracción. Los hallazgos sugieren que existe una buena correlación entre la señal FIBS y las concentraciones intracelulares en el rango de 1-5 mm para la glucosa y 0,3-2 mM de glutamina. En el lote de cultivo de células CHO, estas concentraciones se encuentran en las fases de declive exponenci…

Materials

CHO-S Cells	Life Tecnologies	11619-012	Cell line will vary depending on the goals of the study
pCDNA4/TO vector	Life Tecnologies
TransIT-PRO Transfection Reagent	Mirus Bio	MIR 5700	Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study
Zeocin	Invivogen
CD-CHO medium	Life Technologies	10743-011	Cell growth medium is dependent upon the cells under study
100X HT Supplement	Life Technologies	11067-030
L-Glutamine 200 mM (100X), Liquid	Life Technologies	25030032
InfinitePRO 200 plate reader	Tecan	FLx800TBI	Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted
Filters for plate reader	Tecan	30000463
		(520NM BW 10NM)
		30022786
		(430NM BW 35NM)
		30022787
		(465NM BW 35NM)
Maxiprep Plasmid Purification Kit	Qiagen	12163	Any suitable kit can be substituted
Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit	Invitrogen	A22189	Any suitable kit can be substituted
EnzyChrom  Glutamine Assay Kit	BioAssay systems	EOAC-100	Any suitable kit can be substituted
Improved Neubauer haemocytometer	Fisher Scientific	MNK-420-010N
Incubator	Nuaire	NU-5510E