骨肉腫細胞における光線力学療法の細胞毒性有効性<em>体外</em
Summary
ここで報告されたプロトコルは、細胞株における光線力学療法（PDT）の有効性および動物モデルにおいて治療を適用する前に、PDTの設定の最適化の評価を可能にする。
Abstract
近年では、より少ない全身性副作用、癌に対してより効果的な治療法を見つけることが困難であった。したがって光線力学療法は、それ以上の腫瘍選択的治療のための新規なアプローチである。
酸素の存在下で特定の波長の光で活性化されると、細胞傷害性応答を誘発する1酸素ラジカルを生成し、非毒性の光増感剤（PS）を使用する光線力学療法（PDT）。 FDAによる、ほ ぼ20年前の承認にもかかわらず、PDTは、最近だけのタイプの癌（皮膚、膀胱）とnononcological疾患（乾癬、光線性角化症）2限られた数の治療に使用されます。
PDTの使用の主な利点は、全身性の副作用を防止する局所治療を行うことができることである。また、（神経や血管の周囲などで ）繊細な部位における腫瘍の治療を可能にする。ここでは、intraoperatPDTのIVEアプリケーションは、骨肉腫（OS）で、原発腫瘍の衛星を対象とする骨の腫瘍は、外科的腫瘍切除後に周囲の組織の腫瘍に残さ考えられている。治療は、再発の数を減少時と（術後の）転移のリスクを低減することを目的とする。
本研究では、十分に確立されintratibial OSマウスモデルにおいてヒトの疾患を再現するために使用される広く使用されているOS細胞株の効果的な治療のためのPDTの最適な設定を確立するためにインビトロ PDT処置で提示する。分光光度計や光毒性は、WST-1アッセイを用いて、および生存細胞の計数によって評価し、細胞死を誘導するために652 nmでのmTHPCのレーザー光励起により引き起こされたとPS mTHPCの取り込みを調べた。確立された技術は、動物モデルでの今後の研究のために最適な、PDTの設定を定義するために私達を可能にする。彼らは、PDTの有効性を評価するための簡単かつ迅速なツールです<em> 生体内での適用前にin vitroで。
Introduction
骨肉腫の芸術治療の現在の状態（OS）、原発性骨腫瘍は、ネオアジュバント化学療法と手術との組み合わせを包含する。この治療計画は、現在、60〜70％3、4との間に、化学療法の使用前に約20％からローカライズされた疾患を有する患者の生存率の増加を明らかにした。しかし、過去20年間、地元の疾患を持つOSの患者の全生存期間は4、5を頭打ちしている。さらに、これらの患者の30〜40％は、診断後3年以内に再発および転移性疾患の患者は、20から30パーセント4、6、7の貧しい人々の生存を持ち続ける。これらの患者の転帰を改善するために、新たな治療戦略を開発する必要がある。
光線力学療法（PDT）、むしろ新規な抗癌治療は、photosensiの励起のために特定の波長の光を使用する血流への注入後に腫瘍細胞中に蓄積tizer（PS）。 PSのレーザー光励起は、腫瘍細胞および細胞死を細胞毒性反応を誘発し、酸素の存在下で酸素ラジカルを生成する。この主要なメカニズムに加えて、二つの追加PDTは生物学的プロセスが減少し、腫瘍の成長に寄与する誘発：PDTは、腫瘍の微小血管の血管収縮および血栓形成を引き起こすと、腫瘍内部の結果として、地元の低酸素および無酸素、腫瘍梗塞につながる。最後に、PDTは負傷し、瀕死の腫瘍細胞が局所的免疫応答、PDTのかなりユニークな機能をトリガします。これは、補体系及び樹状細胞の抗原提示8の活性化が関与している。従って、条件は、腫瘍特異的免疫をもたらす、リンパ系細胞のその後の活性化による腫瘍抗原の提示のために作成される。
今のところ、PDTは、軟組織腫瘍及びhyperplのいくつかのタイプを治療するために使用されているアジアの、例えば光線性角化症、バレット食道、気管支内腫瘍、膀胱癌、基底細胞癌、及び頭頸部癌2の姑息的治療として。治療は少しだけ副作用が局所大規模壊死を誘導することが知られ、したがって、選択的に腫瘍組織を根絶する可能性を有している。これらの利点にもかかわらず、PDTの適用は、化学療法薬の投与よりも技術的により厳しいままである。最大効果を達成するために、PS濃度、露光時間、および総光エネルギー伝達を最適化する必要がある。これは、最適化が必要なパラメータの相対的な多数の、それが最初にインビトロで最適な条件を決定する方が効率的であり、in vivo実験で行うことができるが。
下記の実験では、PS 5,10,15,20 -テトラキス（メタ-ヒドロキシフェニル）クロロフィルを用いたPDT のインビトロ効力を試験しおりん、mTHPC（ 図1A）は省略。 mTHPCは現在頭頸部癌の緩和治療のために臨床で使用される医薬品Foscan、活性物質である。これは、低濃度ですでに大量の細胞損傷を誘導し、最も強力なPSの一つであり、それは組織浸透9,10の点で他のPSよりも優れていることが実証された。その光吸収スペクトル（ 図1B）は、それぞれPSを蓄積する組織局在およびPDT誘導のために使用される2つの顕著なピーク、417 nmでのオンおよび652 nmでの第二を示す。
現在、mTHPCためのリポソーム製剤を開発中である。ここでは、このリポソーム製剤の取り込みを定量化するための手順を記述し、2人のOSの細胞株でPDTを行うために、低転移HOSと高転移性の143B細胞。ここに提示されたデータの中には、11以前に報告されている。目ここで説明するEアプローチは、PDTの有効性に転移性表現型の効果を研究することを可能にします。同所免疫不全SCIDマウスの後肢に注入された143B細胞は、intratibial転移原発腫瘍、密接に人間の転移性疾患を模倣したモデルを引き起こす。したがって、提案されたin vitro実験は、最適なPDT設定が保存インビボ実験で使用するための完全に評価するのに適している。
Protocol
Representative Results
Discussion
PDTに応じて最適な細胞毒性を達成するためには、右のレーザ光設定およびインキュベーション時間を選択することが重要である。ここで説明する手順は、PSの取り込みを決定し、in vitroで 、PDT誘導される細胞毒性を定量化するために一貫性があり、効率的です。 PS mTHPCの特定の吸収波長を用いて、PSの細胞取り込みは、直接的に決定することができ、PSは、細胞傷害性活性酸素種を生成…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者は親切に彼らの助けのためのスザンナグレーフェとアルノWieheに感謝し、技術的な専門知識と、リポソームmTHPC製剤を私たちに提供するためbiolitecリサーチ社（イエナ、ドイツ）に感謝したいと思います。また、結果の大部分を生成し、その出版11 coresponsibleたカースティンレイディを、感謝したいと思います。
この作品は、Schweizerischerの法令に基づく連合組織体Balgrist、チューリッヒ大学、チューリッヒKrebsligaだけでなく、ウォルター·L.とヨハンナウルフ財団、チューリッヒ、スイス、EuroNanoMed ERA-NET / SNFスイスからの助成金からの助成金によってからの補助金によって支えられて国立科学財団31NM30-1分の131004。この作品はまた、カントンチューリッヒの筋骨格系の腫瘍学のためのHSM（高度専門医療）プログラムによってサポートされていました。
Materials
| DMEM | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-883 | |
| HAM F12 | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-817 | |
| heat-inactivated fetal calf serum | GIBCO, Basel, Switzerland | 10500-064 | |
| mTHPC | biolitec research GmbH, Jena, Germany | As this liposomal formulation is originating from R & D no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity) |
|
| Spectramax Gemini XS plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ID# 861 | |
| Microscope Zeiss Observer.Z1 | Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany | ||
| Ceralas PDT 652 nm Laser | Biolitec AG, Jena, Germany | LD652nm2W400u | |
| Water-soluble tetrazolium (WST) reagent | Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland | 1644807 |
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