Spiraalvormige Organisatie van Blood stollingsfactor VIII op Lipid nanobuisjes
Summary
We presenteren een combinatie van cryo-elektronenmicroscopie, lipide nanotechnologie en structuuranalyse aangebracht op het membraan gebonden structuur van twee zeer homologe FVIII vormen lossen: mens en varken. De in ons laboratorium ontwikkeld om de twee functionele recombinante FVIII vormen spiraalvormig organiseren negatief geladen lipide nanotubes (LNT) methode wordt beschreven.
Abstract
Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) 1 is een krachtige aanpak om de functionele structuur van eiwitten en complexen in een gehydrateerde toestand en membraan milieu 2 onderzoeken.
Coagulatie Factor VIII (FVIII) 3 is een multi-domein bloedplasma glycoproteïne. Gebrek of tekort aan FVIII is de oorzaak voor Hemofilie type A – een ernstige bloeden stoornis. Na proteolytische activatie FVIII bindt aan de serineprotease Factor IXa op de negatief geladen bloedplaatjes membraan, dat essentieel is voor normale bloedstolling 4. Ondanks de centrale rol FVIII speelt bij de bloedstolling, structurele informatie voor zijn membraangebonden staat onvolledig 5. Recombinant FVIII concentraat is de meest effectieve middel tegen type Hemofilie A en in de handel verkrijgbaar FVIII kan worden uitgedrukt als mens of varken, beide aldus functionele complexen met humaan Factor IXa 6,7.
"> In deze studie presenteren we een combinatie van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM), lipide nanotechnologie en structuuranalyse aangebracht op het membraan gebonden structuur van twee zeer homologe FVIII vormen lossen. Mens en varken De in ons laboratorium ontwikkelde methodologie de twee functionele recombinante FVIII vormen spiraalvormig organiseren negatief geladen lipide nanotubes (LNT) wordt beschreven. De representatieve resultaten demonstreren dat onze benadering voldoende gevoelig voor de verschillen in de schroeflijnvormige ordening tussen twee zeer homologe worden (86% sequentie identiteit definiëren ) eiwitten. Gedetailleerde protocollen voor de spiraalvormige organisatie, Cryo-EM en electron tomography (ET) gegevensverzameling krijgen. de tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) structuuranalyse toegepast op de 3D reconstructies van mens en varken vinden FVIII-LNT wordt besproken. De gepresenteerde mens en varken FVIII-LNT structuren tonen het potentieel van de voorgestelde methodologie om berekend wordene de functionele, membraan-gebonden organisatie van bloed stollingsfactor VIII, met een hoge resolutie.Introduction
Bloed stollingsfactor VIII (FVIII) is een groot glycoproteïne van 2332 aminozuren georganiseerd in zes domeinen: A1-A2-B-A3-C1-C2-3. Na activatie FVIII Trombine fungeert als cofactor voor Factor IXa bij de membraangebonden TENase complex. Binding van geactiveerde FVIII (FVIIIa) naar FIXa in een membraan afhankelijk wijze verhoogt FIXa proteolytische rendement meer dan 10 5 maal, wat essentieel is voor een efficiënte bloedstolling 4. Ondanks de belangrijke rol speelt bij coagulatie FVIII en TENase complexvorming, het functionele membraan gebonden FVIII structuur nog worden opgelost.
Om dit aan te pakken, hebben enkele lipide dubbellaag nanobuisjes (LNT) rijk aan fosfatidylserine (PS) kan binden met hoge affiniteit FVIII 8, 9 en lijkt het geactiveerde bloedplaatjes oppervlak ontwikkeld 10. Opeenvolgende spiraalvormige ordening FVIII gebonden aan LNT is bewezen doeltref zijnve voor de structuurbepaling van FVIII-membraan gebonden toestand door Cryo-EM 5. Gefunctionaliseerde LNT zijn een ideaal systeem om eiwit-eiwit en eiwit-membraan interacties schroeflijnvormig georganiseerde membraan geassocieerde proteïnen Cryo-EM 11, 12. Cryo-EM heeft het voordeel boven traditionele structurele werkwijzen zoals röntgenkristallografie en NMR, als het monster wordt bewaard in het dichtst bij de fysiologische omgeving (buffer, membraan, pH), zonder toevoegingen en isotopen. Bij FVIII, bestuderen van de membraangebonden structuur met deze techniek is nog fysiologisch relevant, aangezien LNT lijken dicht door grootte, vorm en samenstelling van de pseudopodia van de geactiveerde bloedplaatjes waar TENase complexen assembleren in vivo.
Gebreken en tekort aan FVIII oorzaak hemofilie A, een ernstige bloeden aandoening die 1 op de 5000 mannen van de menselijke bevolking 4, 6. De meeste effectieve therapie voor Hemofilie A is levenslang toedienen van recombinant FVIII (hFVIII). Een belangrijke complicatie van de recombinante FVIII Hemofilie A therapie is de ontwikkeling van remmende antilichamen tegen de menselijke vorm die ongeveer 30% van hemofilie A patiënten 13. In dit geval is fVIII van varken (pFVIII) concentraat gebruikt, omdat varkens FVIII displays laag kruisreactiviteit met remmende antilichamen tegen humane factor VIII en vormen functionele complexen met humaan FIXa 7. Vaststelling van de membraangebonden organisatie van zowel varkens en menselijke FVIII vormen is belangrijk om de structurele basis van FVIII cofactorfunctie en implicaties bloed hemostase begrijpen.
In deze studie beschrijven we een combinatie van lipide nanotechnologie, Cryo-EM en structuuranalyse ontworpen om de membraangebonden ordening twee zeer homologe FVIII vormen lossen. De gepresenteerde Cryo-EM databank 3D structuren schroeflijnvormig georganiseerd Porcine en humane FVIII op negatief geladen LNT tonen het potentieel van de voorgestelde nanotechnologie als basis voor structuurbepaling van FVIII en membraangebonden stollingsfactoren en complexen in een fysiologische omgeving membraan.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit werk een methode gepresenteerd om tussen twee membraangebonden organisaties sterk homoloog eiwit: mens en varken FVIII zelf-geassembleerde op lipide nanobuizen aangetroffen in het menselijk lichaam omstandigheden.
In de beschreven procedure, zijn mens en varken FVIII succes spiraalvormig georganiseerd lipide nanobuisjes, dat is de meest kritische stap. De volgende belangrijke stap is om het monster in dunne amorfe ijs in de buurt van vloeibare N 2</sub…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door een Nationaal Scientist Development subsidie van de American Heart Association: 10SDG3500034 en UTMB-NCB beginnen te SodM up fondsen. De auteurs erkennen de Cryo-EM en Scientific Computing faciliteiten op het Sealy Center for Structural Biology bij UTMB ( www.scsb.utmb.edu ), evenals Drs. Steve Ludtke en Ed Egelman voor hulp bij de 2D-en 3D spiraalvormige reconstructie algoritmen.
Materials
| JEM2100 with LaB6 | JEOL Ltd. | JEM-2100 | operated at 200 kV |
| with TEMCON software | JEOL Ltd. | ||
| Gatan626 Cryo-holder | Gatan, Inc. | 626.DH | cooled to -175 °C |
| with temperature controler unit | Gatan, Inc. | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Inc. | US4000 | 4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution |
| Solarus Model 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. | ||
| Vitrobot Mark IV | FEI | ||
| Materials | |||
| Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid | Ted Pella | 01821 | plasma cleaned for 10 s on high power |
| Quantifoil R2/2 300 mesh | Electron Microscopy Sciences | Q225-CR2 | Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes |
| Uranyl acetate dihydrate | Ted Pella | 19481 | 1% solution, filtered |
| Galactosyl ceramide | Avanti Polar Lipids Inc. | 860546 | |
| Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids Inc. | 840035 | |
| Software | |||
| EM software Digital Micrograph | Gatan, Inc. | http://www.gatan.com/DM/ | |
| EM software EMAN | free download | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ | |
| EM software Spider | free download | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
| EM software IHRSR | free download | Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | |
| EM software (IMOD) | free download | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
| EM software (SerialEM) | free download | ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/ | |
| UCSF-Chimera | free download | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html |
Referenzen
- Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).
- Fujiyoshi, Y., Unwin, N. Electron crystallography of proteins in membranes. Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).
- Toole, J. J., et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature. 312, 342-347 (1984).
- Fay, P. J. Factor VIII structure and function. International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).
- Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. Domain organization of membrane-bound factor VIII. Biopolymers. , (2013).
- Pipe, S. W. Hemophilia: new protein therapeutics. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).
- Gatti, L., Mannucci, P. M. Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies. Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).
- Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes. Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).
- Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes. FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).
- Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway. Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins. Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).
- Egelman, E. H. Reconstruction of helical filaments and tubes. Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).
- Lusher, J. M. Development and introduction of recombinant factor VIII–a clinician’s experience. Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).
- Thim, L., et al. Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8). Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).
- Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).
- Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).
- Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).
- Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
- Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. 3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography. Blood. 99, 1215-1223 (2002).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).
