Использование этикеток без оптические биосенсоры для обнаружения модуляции калиевых каналов на G-белком рецепторов
Summary
Методы оптический биосенсор может обнаружить изменения в массы вблизи плазматической мембраны в живых клетках и позволяют следовать клеточные ответы в обоих отдельных клеток и популяций клеток. Этот протокол будет описывать обнаружение модуляции калиевых каналов по G-белком рецепторов в неповрежденных клеток, использующих этот подход.
Abstract
Ионные каналы управления электрических свойств нейронов и других типов клеток возбудимых путем выборочного позволяя ионам проходить через плазматическую мембрану 1. Для регулирования возбудимость нейронов, биофизические свойства ионных каналов модифицируются сигнальных белков и молекул, которые часто связываются с самих каналов, чтобы сформировать гетеромерный канал сложную 2,3. Традиционные анализы рассматривая взаимодействие между каналами и регуляторных белков требуют экзогенных метки, которые потенциально могут изменить поведение протеина и уменьшить физиологическое значение цели, обеспечивая при этом мало информации о времени ходе взаимодействий в живых клетках. Оптические биосенсоры, такие как системы X-BODY Biosciences BIND сканера, использовать новый без наклеек технологии, резонансную длину волны решетку (RWG) оптические биосенсоры, чтобы обнаружить изменения в резонансной отраженный свет рядом с биосенсора. Этот анализ позволяет обнаруживать относительноеизменение массы в нижней части живой клетки прилипших к поверхности биосенсора результате лиганд индуцированных изменений в клеточной адгезии и распространения, токсичность, пролиферации и изменений в белок-белковых взаимодействий вблизи плазматической мембраны. РРГ оптические биосенсоры были использованы для обнаружения изменений в массе вблизи плазматической мембране клеток после активации G-белком рецепторов (GPCR), рецепторных тирозинкиназ и других рецепторов клеточной поверхности. Индуцированной лигандом изменения в ионном канале-белковых взаимодействий также могут быть изучены при применении этого теста. В этой статье мы опишем экспериментальное процедуру, используемую для обнаружения модуляции тормозной-B натрия активированного калия (K Na) каналов по GPCRs.
Introduction
Изучение живых клеток в их физиологически соответствующем контексте является ключевым для понимания биологические функции клеточных мишеней. Тем не менее, анализы рассматривая взаимодействие между каналами и нормативных цитоплазматических белков, таких как коиммунопреципитации подтверждено анализами, как правило, предоставляют мало информации о времени ходе взаимодействий в живых клетках. Большинство текущих анализов на основе клеток измеряют специфический клеточный событие, например транслокации флуоресцентно меченого белка. Эти анализы требуют модификации белков, представляющих интерес, которые потенциально могут изменить поведение протеина и уменьшить физиологическое значение цели. Неинвазивная клеток, основанные анализы, которые не требуют манипуляции с системой, обеспечивают непрерывное измерение клеточной активности и позволяют исследования клеток в их наиболее физиологически отношение государства 4.
Оптические биосенсоры предназначены для производстваизмеримое изменение в характеристике света, который соединен с поверхности датчика. Оптические биосенсоры, которые используют неоднородных волн, в том числе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и резонансную длину волны решетку методы (РРГ), были в основном используется для обнаружения сходства и кинетики молекул, связывающихся с их биологических рецепторов, иммобилизованных на поверхности сенсора. Совсем недавно, коммерчески доступные РРГ биосенсоры были разработаны, чтобы позволить обнаруживать относительное изменение массы в нижней части клеток прикрепленных к поверхности сенсора с высоким пространственным разрешением (до 3,75 мкм / пиксель) 5. Эти биосенсоры может обнаружить изменения в массе около плазматической мембраны живых клеток, которые являются результатом стимуляции, таких как клеточной адгезии и распространения, токсичность, пролиферации и сигнальных путей, вызываемых различными рецепторами клеточной поверхности, включая G-белком рецепторов (GPCR) 6 . РРГ биосенсоры обнаружить относительную чанGE в показателя преломления в зависимости от относительного изменения массы в пределах 150 нм биосенсора 7. Когда клетки высевают в биосенсора, это изменение в показателе преломления отражает изменение массы около плазматической мембраны клетки в результате изменений в клеточной присоединения к биосенсора. Этот протокол будет обсудить обнаружение канала-белковых взаимодействий с помощью РРГ биосенсоров.
Системы сбора данных РРГ состоят из нескольких компонентов. Поскольку X-BODY Biosciences BIND Сканер был использован для этих экспериментов, мы будем называть компонентами для этой конкретной системы, которая состоит из ридере, связанных биосенсоров, приобретения программного обеспечения BIND Scan и BIND Посмотреть анализа программного обеспечения 8. Фотонный кристалл биосенсоры, далее будет называться оптические биосенсоры, состоят из периодического расположения диэлектрика и материала в 2 или 3-х измерениях, что предотвращает распространение света в конкретныхдлины волн и направления. Фотонные кристаллические структуры основаны на явление, называемое аномалия Вуда. Впервые обнаружил Вудом в 1902 году, эти аномалии эффекты, наблюдаемые в спектре света, отраженного от оптических дифракционных решеток, где быстрые изменения в интенсивности отдельных порядков дифракции происходят в определенных узких частотных полос. В 1962 году Хессел и Олинера представил новую теорию аномалий Вуда, в котором конечный период решетки генерирует постоянный резонансной длины волны 9. В оптических биосенсоров, описанных здесь, Аномалии Вуда используются для производства биосенсор RWG, что при стимуляции с белым светом отражает лишь очень узкую полосу длин волн (как правило, между 850-855 нм).
Отдельные биосенсоры состоят из низко-преломления пластического материала с периодической структурой поверхности, покрытой тонким слоем с высоким содержанием двуокиси преломления диэлектрического материала титана (TiO 2). Когда Biosensили освещается с широким длин волн источника света, оптическая решетка фотонных кристаллов отражает узкий диапазон длин волн света, который измеряется с помощью спектрофотометра в BIND сканера. Пик интенсивности отраженных волн (Пиковая длина волны значение или PWV) рассчитывается из сигнала. PWV света изменяется при изменении показателя преломления в результате к увеличению или уменьшению массы в пределах близости (~ 150 нм) поверхности биосенсора. Оптические биосенсоры включены в стандартный общества по Биомолекулярных наук (SBS) 384-луночный микропланшет для анализов, используемых в этих экспериментах.
RWV биосенсоры используются для обнаружения изменений при добавлении экзогенных сигналов в живых клетках 10. Клетки культивировали непосредственно на поверхности биосенсора RWG и изменение в локальной показателя преломления контролируется при обработке конкретных стимулов. Направление изменения массы в биосенсора может бытьопределяют, потому что увеличение локального индекса рефракции результатов с увеличением массы вблизи биосенсора и измеряется как увеличение СПВ. Наоборот, уменьшение массы приводит к снижению СПВ. Изменение обнаруженного СПВ может быть результатом многочисленных клеточных событий, в том числе изменения в клеточной адгезии, белка набора / освобождения, эндоцитоза и утилизации, экзоцитоза, апоптоза и цитоскелетного перегруппировки. Например, анализ может быть обнаружения изменений в канал-белковых взаимодействий между калиевых каналов и других цитоплазматических или цитоскелета компонентов. Событие, однако, должен происходить в пределах зоны обнаружения ~ 150 нм вблизи биосенсора, а в случае прикрепленным клетки, вблизи плазматической мембране. Приобретение клеточных ответов выполняется с помощью программного обеспечения BIND сканирования и представление изображения каждого из 384 скважин в SBS пластины генерируется. Эта система имеет разрешение до 3,75 мкм / пиксель, что позволяет обнаруживать события в одиночных камерах, имогут быть использованы либо с клеточных линий (например, НЕК293 клетках СНО или) или с более физиологически соответствующих первичных клеток. Анализ изображений с BIND View программного обеспечения позволяет обнаружить клеточные реакции как в личности и популяций клеток. Как биосенсоры были включены в стандартный SBS 384-луночных микропланшет, система легко адаптируется к высокопроизводительного скрининга (HTS).
Резонанс-волны решетки оптические биосенсоры ранее использовались для обнаружения изменений в массе около плазматической мембране клеток после активации GPCRs 11. Наша лаборатория клонировал двух калиевые каналы натрия активированного (К Na) отними-B и Slick 12. Активность обоих слабину-B и гладкий каналов было показано, что очень сильно зависит от прямой активации протеинкиназы С (РКС) 13. Активация Gα д белком рецепторов, таких как М1 мускаринового рецептора и mGluR1 метаботропного глутаматного Receptor, мощно регулирует деятельность канала через активацию ПКС. Эти каналы K Na способствовать нейронов адаптации во время длительного стимуляции и регулируют точность сроков действия потенциалов 14. Натяжные каналы, как известно, взаимодействовать с различными цитоплазматических сигнальных молекул, в том числе FMRP, хрупкой Х умственной отсталости белка 15,16. Мутации в Слэк результате в нескольких Перенастройка частичного изъятия младенчества (MMPSI), раннего натиска формы эпилепсии в результате чего задержка развития 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Z премьер (Z ') фактором является общей статистический метод для количественного определения качества высокой пропускной скрининге 20, и потому, что скрининг агонистов GPCR в этом анализе произошло в SBS совместимый анализе 384-а, обеспечивает превосходное мера надежности и обоснован…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность доктору Янъян Янь в лаборатории доктора Фреда Сигуорта в Йельском университете за щедрое пожертвование НЕК293, стабильно экспрессирующих белок крысы Слэк-B. Кроме того, авторы благодарны доктору Сигуорта для крио-электронной микроскопии гомологии модели Слэк отображается в видео внедрения. Это исследование было поддержано NIH грантов DH067517 и NS073943 к LKK
Materials
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
Referenzen
- Hille, B. . Ion Channels of Excitable Membranes. , (1992).
- Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Shamah, S. M., Cunningham, B. T. Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors. Analyst. 136, 1090-1102 (2011).
- Cunningham, B. T., Laing, L. M. i. c. r. o. p. l. a. t. e. -. b. a. s. e. d. label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics. Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).
- Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).
- Cunningham, B. T., et al. Label-free assays on the BIND system. J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).
- Hessel, A. a. O., A, A. A New Theory of Wood’s Anomalies on Optical Gratings. Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).
- Cunningham, B. T., Laing, L. G. Advantages and application of label-free detection assays in drug screening. Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).
- Lee, P. H. Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).
- Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. For K+ channels, Na+ is the new Ca2. Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).
- Santi, C. M., et al. Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators. J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).
- Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons. J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).
- Brown, M. R., et al. Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel. 13, 819-821 (2010).
- Zhang, Y., et al. Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels. J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).
- Barcia, G., et al. De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy. Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).
- Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).
- Nelson, C. D., et al. Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins. Science. 315, 663-666 (2007).
- Zhang, J. H. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Gribbon, P., et al. Evaluating real-life high-throughput screening data. J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).
