Методы оптический биосенсор может обнаружить изменения в массы вблизи плазматической мембраны в живых клетках и позволяют следовать клеточные ответы в обоих отдельных клеток и популяций клеток. Этот протокол будет описывать обнаружение модуляции калиевых каналов по G-белком рецепторов в неповрежденных клеток, использующих этот подход.
Ионные каналы управления электрических свойств нейронов и других типов клеток возбудимых путем выборочного позволяя ионам проходить через плазматическую мембрану 1. Для регулирования возбудимость нейронов, биофизические свойства ионных каналов модифицируются сигнальных белков и молекул, которые часто связываются с самих каналов, чтобы сформировать гетеромерный канал сложную 2,3. Традиционные анализы рассматривая взаимодействие между каналами и регуляторных белков требуют экзогенных метки, которые потенциально могут изменить поведение протеина и уменьшить физиологическое значение цели, обеспечивая при этом мало информации о времени ходе взаимодействий в живых клетках. Оптические биосенсоры, такие как системы X-BODY Biosciences BIND сканера, использовать новый без наклеек технологии, резонансную длину волны решетку (RWG) оптические биосенсоры, чтобы обнаружить изменения в резонансной отраженный свет рядом с биосенсора. Этот анализ позволяет обнаруживать относительноеизменение массы в нижней части живой клетки прилипших к поверхности биосенсора результате лиганд индуцированных изменений в клеточной адгезии и распространения, токсичность, пролиферации и изменений в белок-белковых взаимодействий вблизи плазматической мембраны. РРГ оптические биосенсоры были использованы для обнаружения изменений в массе вблизи плазматической мембране клеток после активации G-белком рецепторов (GPCR), рецепторных тирозинкиназ и других рецепторов клеточной поверхности. Индуцированной лигандом изменения в ионном канале-белковых взаимодействий также могут быть изучены при применении этого теста. В этой статье мы опишем экспериментальное процедуру, используемую для обнаружения модуляции тормозной-B натрия активированного калия (K Na) каналов по GPCRs.
Изучение живых клеток в их физиологически соответствующем контексте является ключевым для понимания биологические функции клеточных мишеней. Тем не менее, анализы рассматривая взаимодействие между каналами и нормативных цитоплазматических белков, таких как коиммунопреципитации подтверждено анализами, как правило, предоставляют мало информации о времени ходе взаимодействий в живых клетках. Большинство текущих анализов на основе клеток измеряют специфический клеточный событие, например транслокации флуоресцентно меченого белка. Эти анализы требуют модификации белков, представляющих интерес, которые потенциально могут изменить поведение протеина и уменьшить физиологическое значение цели. Неинвазивная клеток, основанные анализы, которые не требуют манипуляции с системой, обеспечивают непрерывное измерение клеточной активности и позволяют исследования клеток в их наиболее физиологически отношение государства 4.
Оптические биосенсоры предназначены для производстваизмеримое изменение в характеристике света, который соединен с поверхности датчика. Оптические биосенсоры, которые используют неоднородных волн, в том числе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и резонансную длину волны решетку методы (РРГ), были в основном используется для обнаружения сходства и кинетики молекул, связывающихся с их биологических рецепторов, иммобилизованных на поверхности сенсора. Совсем недавно, коммерчески доступные РРГ биосенсоры были разработаны, чтобы позволить обнаруживать относительное изменение массы в нижней части клеток прикрепленных к поверхности сенсора с высоким пространственным разрешением (до 3,75 мкм / пиксель) 5. Эти биосенсоры может обнаружить изменения в массе около плазматической мембраны живых клеток, которые являются результатом стимуляции, таких как клеточной адгезии и распространения, токсичность, пролиферации и сигнальных путей, вызываемых различными рецепторами клеточной поверхности, включая G-белком рецепторов (GPCR) 6 . РРГ биосенсоры обнаружить относительную чанGE в показателя преломления в зависимости от относительного изменения массы в пределах 150 нм биосенсора 7. Когда клетки высевают в биосенсора, это изменение в показателе преломления отражает изменение массы около плазматической мембраны клетки в результате изменений в клеточной присоединения к биосенсора. Этот протокол будет обсудить обнаружение канала-белковых взаимодействий с помощью РРГ биосенсоров.
Системы сбора данных РРГ состоят из нескольких компонентов. Поскольку X-BODY Biosciences BIND Сканер был использован для этих экспериментов, мы будем называть компонентами для этой конкретной системы, которая состоит из ридере, связанных биосенсоров, приобретения программного обеспечения BIND Scan и BIND Посмотреть анализа программного обеспечения 8. Фотонный кристалл биосенсоры, далее будет называться оптические биосенсоры, состоят из периодического расположения диэлектрика и материала в 2 или 3-х измерениях, что предотвращает распространение света в конкретныхдлины волн и направления. Фотонные кристаллические структуры основаны на явление, называемое аномалия Вуда. Впервые обнаружил Вудом в 1902 году, эти аномалии эффекты, наблюдаемые в спектре света, отраженного от оптических дифракционных решеток, где быстрые изменения в интенсивности отдельных порядков дифракции происходят в определенных узких частотных полос. В 1962 году Хессел и Олинера представил новую теорию аномалий Вуда, в котором конечный период решетки генерирует постоянный резонансной длины волны 9. В оптических биосенсоров, описанных здесь, Аномалии Вуда используются для производства биосенсор RWG, что при стимуляции с белым светом отражает лишь очень узкую полосу длин волн (как правило, между 850-855 нм).
Отдельные биосенсоры состоят из низко-преломления пластического материала с периодической структурой поверхности, покрытой тонким слоем с высоким содержанием двуокиси преломления диэлектрического материала титана (TiO 2). Когда Biosensили освещается с широким длин волн источника света, оптическая решетка фотонных кристаллов отражает узкий диапазон длин волн света, который измеряется с помощью спектрофотометра в BIND сканера. Пик интенсивности отраженных волн (Пиковая длина волны значение или PWV) рассчитывается из сигнала. PWV света изменяется при изменении показателя преломления в результате к увеличению или уменьшению массы в пределах близости (~ 150 нм) поверхности биосенсора. Оптические биосенсоры включены в стандартный общества по Биомолекулярных наук (SBS) 384-луночный микропланшет для анализов, используемых в этих экспериментах.
RWV биосенсоры используются для обнаружения изменений при добавлении экзогенных сигналов в живых клетках 10. Клетки культивировали непосредственно на поверхности биосенсора RWG и изменение в локальной показателя преломления контролируется при обработке конкретных стимулов. Направление изменения массы в биосенсора может бытьопределяют, потому что увеличение локального индекса рефракции результатов с увеличением массы вблизи биосенсора и измеряется как увеличение СПВ. Наоборот, уменьшение массы приводит к снижению СПВ. Изменение обнаруженного СПВ может быть результатом многочисленных клеточных событий, в том числе изменения в клеточной адгезии, белка набора / освобождения, эндоцитоза и утилизации, экзоцитоза, апоптоза и цитоскелетного перегруппировки. Например, анализ может быть обнаружения изменений в канал-белковых взаимодействий между калиевых каналов и других цитоплазматических или цитоскелета компонентов. Событие, однако, должен происходить в пределах зоны обнаружения ~ 150 нм вблизи биосенсора, а в случае прикрепленным клетки, вблизи плазматической мембране. Приобретение клеточных ответов выполняется с помощью программного обеспечения BIND сканирования и представление изображения каждого из 384 скважин в SBS пластины генерируется. Эта система имеет разрешение до 3,75 мкм / пиксель, что позволяет обнаруживать события в одиночных камерах, имогут быть использованы либо с клеточных линий (например, НЕК293 клетках СНО или) или с более физиологически соответствующих первичных клеток. Анализ изображений с BIND View программного обеспечения позволяет обнаружить клеточные реакции как в личности и популяций клеток. Как биосенсоры были включены в стандартный SBS 384-луночных микропланшет, система легко адаптируется к высокопроизводительного скрининга (HTS).
Резонанс-волны решетки оптические биосенсоры ранее использовались для обнаружения изменений в массе около плазматической мембране клеток после активации GPCRs 11. Наша лаборатория клонировал двух калиевые каналы натрия активированного (К Na) отними-B и Slick 12. Активность обоих слабину-B и гладкий каналов было показано, что очень сильно зависит от прямой активации протеинкиназы С (РКС) 13. Активация Gα д белком рецепторов, таких как М1 мускаринового рецептора и mGluR1 метаботропного глутаматного Receptor, мощно регулирует деятельность канала через активацию ПКС. Эти каналы K Na способствовать нейронов адаптации во время длительного стимуляции и регулируют точность сроков действия потенциалов 14. Натяжные каналы, как известно, взаимодействовать с различными цитоплазматических сигнальных молекул, в том числе FMRP, хрупкой Х умственной отсталости белка 15,16. Мутации в Слэк результате в нескольких Перенастройка частичного изъятия младенчества (MMPSI), раннего натиска формы эпилепсии в результате чего задержка развития 17.
Z премьер (Z ') фактором является общей статистический метод для количественного определения качества высокой пропускной скрининге 20, и потому, что скрининг агонистов GPCR в этом анализе произошло в SBS совместимый анализе 384-а, обеспечивает превосходное мера надежности и обоснован…
The authors have nothing to disclose.
Авторы выражают благодарность доктору Янъян Янь в лаборатории доктора Фреда Сигуорта в Йельском университете за щедрое пожертвование НЕК293, стабильно экспрессирующих белок крысы Слэк-B. Кроме того, авторы благодарны доктору Сигуорта для крио-электронной микроскопии гомологии модели Слэк отображается в видео внедрения. Это исследование было поддержано NIH грантов DH067517 и NS073943 к LKK
DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |