חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

Summary

פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיוניים.

Abstract

ג'ל אלקטרופורזה דו ממדים (2DE) היא כלי רב עוצמה כדי לגלות שינויי proteome פוטנציאליות הקשורים לתנאים פיסיולוגיים או פתולוגי שונים. בעיקרון, טכניקה זו מבוססת על הפרדת החלבונים לפי הנקודה איזואלקטרית בשלב ראשון, ושנית על פי המשקלים המולקולריים שלהם על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide SDS (SDS-PAGE). בדוח זה מדגם פרוטוקול הכנה מותאם לכמות קטנה של רקמה שלאחר המוות ומוח עכבר אנושי מתואר. שיטה זו מאפשרת לבצע שתי אלקטרופורזה דו ממדי הבדל הקרינה ג'ל (2D-DIGE) וimmunoblotting 2DE המיני. השילוב של גישות אלו מאפשר לאדם למצוא לא רק חלבונים חדשים ו / או שינויים בחלבון בזכות הביטוי שלהם לתאימות שלה עם זיהוי ספקטרומטריית מסה, אלא גם תובנה חדשה אימות סמנים. לפיכך, מיני 2DE מצמידים את ההיתרים מערביים סופג לזהות ולאמת את הודעה-Translational שינויים, פירוק חלבונים ומספק השוואה איכותית בין תנאים ו / או טיפולים שונים. בזאת, אנו מספקים שיטה ללמוד רכיבים של אגרגטים חלבון שנמצאו בספירה ודימנציה גופיפי לוי כגון פפטיד עמילואיד בטא ואלפא סינוקלאין. השיטה שלנו ובכך ניתן להתאים לניתוח proteome וחלבונים מסיסים לחלץ מדגמי רקמת המוח ועכברים אנושיים מדי. במקביל, היא עשויה לספק מידע שימושי לחקר מסלולים מולקולריים ותאיים המעורבים במחלות ניווניות כמו גם סמנים ביולוגיים רומן פוטנציאליים ומטרות טיפוליות.

Introduction

הפרעות נפשיות ונוירולוגיות מייצגות 13% מהנטל העולמי של מחלה, אתגרים חדשים כמו מנגנונים pathophysiological, גורמי סיכון וסמנים ביולוגיים prodromal חייבים להיחקר ^1. בקנה אחד עם מטרה זו, מחקרי פרוטאומיקה של המוח האנושי הפכו הכרחיים כדי לחשוף את המסלולים מולקולריים מעורבים בתהליכים כמו זיכרון, התנהגות, רגשות ופלסטיות עצבית למשל, לא רק לפיסיולוגי, אלא גם למצבים פתולוגיים. לכן, השימוש במודלים של בעלי חיים ובאופן ספציפי יותר עכברים הטרנסגניים, מביא מגוון רחב של אפשרויות על מנת לחקות את אטיולוגיה של מחלות המוח ניווניות ^2.

פרוטאומיקה גישות זמינות כיום על מנת להשיג את נקודות המבט חדשים בתחום מדעי המוח. אלקטרופורזה דו ממדי ג'ל (2DE) היא שיטה פשוטה ורבה עוצמה סבירה, המאפשרת להשוות את proteome של מגוון רחב של דוגמאות. יתר על כן, הוא גםשיטה רבת עוצמה לבודד את חלבון מתערובת מורכבת על מנת לזהות ולנתח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסה. טכניקה זו בעצם מורכבת בשני שלבים רצופים: 1) הפרדת חלבונים לפי הנקודה איזואלקטרית (PI) על ידי isoelectrofocusing (IEF). לייתר דיוק, פוטנציאל חשמלי מוחל על פני רצועות acrylamide immobiline בין שיפוע pH ולאחר מכן החלבונים יעברו ולהתמקד בפיי נחוש בפונקציה של מטען נטו הגלובלי שלהם. 2) חלבוני Isoelectrically ממוקדים הם מפוגלים ומטען שלילי על ידי התוספת של נתרן גופרתי dodecyl (SDS), ובכך חלבונים במבנה הראשון שלהם מופרדים בהתאם למשקל המולקולרי לכאורה שלהם (MW) על ידי-SDS ^3. שני מאפיינים ייחודיים אלה מאפשרים לנו להתמודד עם ערך כפול ללכת רחוק יותר במחקר של proteome. מצד אחד גישה זו מציעה את האפשרות לבצע ניתוח כמוני באמצעות צבעים מינימאליים שיטת 2D-DIGE, ומצד שני qualitativניתוח דואר על ידי מיני 2DE מצמידים מערבי סופג.

ניתוח כמותי של 2D-DIGE מעניק ביטוי חלבון משתנה בכל רחבי proteome המדגם. בקצרה, דגימות מסומנות עם שלוש cyanines (Cy2, Cy3 וCy5) פולטת בשלושה אורכי גל שונים (כחול, ירוק ואדום). צבעים מינימאליים פלואוריד אלה המכילים קבוצת succinimidyl אסתר N-הידרוקסי מגיבים עם קבוצת ε-אמינו של שאריות lysines של חלבונים וכתוצאה מכך אגרות חוב אמיד קוולנטיים ^4. שאריות ליזין מסומנות רק בין 1-3% ובכך מונע בנוסף תוויות מרובות לכל חלבון ושינויים גדולים תשלום נטו ^{5, 6.} Cy3 וCy5 משמשים לעתים קרובות כדי לתייג את שני מדגמים בלתי תלויים ואילו Cy2 תגי תמהיל שלהן משקל שווה בדגימות כדי להשוות. שני היתרונות העיקריים הם כי כל הדגימות שכותרתו הן מעורבות וIEF ו- SDS מתבצעים בג'ל אחד בפעם אחת לכל שלב, תוך הימנעות מהשתנות היתר בקרב ניסויים בשל ג'לי השוואה. יתר על כן, הוא מציג סף זיהוי גבוה של כ 1 femtomole של חלבון ^7. ג'לים נסרקים ותוכנת 2D משווה את תמונות 2D ג'ל הקרינה, שבו Cy2 משמשת כתקן המאפשר זיהוי של הבדלים סטטיסטיים בין הכתמים לזיהוי האחורי שלהם על ידי ספקטרומטריית מסה פנימי. תוכנת ניתוח 2D באמצעות התקן הפנימי משיגה זיהוי מהיר של פחות מ -10% מהבדלים בין דגימות עם יותר מ 95% של ביטחון סטטיסטי ^8.

ניתוח איכותני על ידי מיני 2DE הוא צעד חיוני לאפיון חלבונים. העיקרון הוא אותו כפי שתואר לעיל עבור PI והפרדת MW, אבל במקרה הזה חלבונים מועברים מג'ל polyacrylamide קטן קרום וimmunoblotting מתבצע לאחר מכן. בעוד ג'ל אלקטרופורזה ממד אחד מספקת שינויים בביטוי חלבונים לאחד או כמה אפיטופים חלבון בתפקוד של הנוגדן, information של מיני 2DE מעניק עם שני פרמטרים נוספים. ראשית, isovariants חלבון השינוי בתפקוד של פיי, המצביע על כך שלאחר translational שינויים עשויים להתרחש. שנית, זיהוי ספקטרומטריית מסה עשויה להצביע על zymogens הסביר ומוצרים קטבולי של חלבונים. לכן, שינויים שנצפו על ידי 2D-DIGE צפויים מעיד על המנגנונים העומדים בבסיס שינויים בפרופיל proteome הגלובלי. מערכים של immunoblots בין כמה דוגמאות מאותה epitope החלבון / s על ידי מיני 2DE עשויים לשקף שינויי חומציות לשפוך אור לתוך וריאציות לאחר translational מעט נצפו או אפילו לא על ידי immunoblotting monodimensional ^{9, 10.} יתר על כן, ניתוח זה מודיע על אתרי מחשוף הפוטנציאליים בשל הידע של הצרכן וMW של השאריות מטבולי ^11,12.

השילוב של שתי טכניקות אלה מספק ניתוח פרוטאומיקה משלים. מצד אחד 2D-DIGE מקנה typדואר של הבדלים המאפשרים בידוד מדויק של פוליפפטידים הביטוי שלו הוא שונה. הבדלים אלה כוללים למעשה להופעה או ההיעלמות של נקודה או עלייה / ירידה של עוצמת נתון אחד על ידי ניתוח תוכנה של ג'לי הניאון. עם זאת, התצפיות הללו על ידי עצמם הן סבירה כדי להסביר את טיבו של השינוי שנצפה. מסיבות אלה, ברגע שפוליפפטיד בודד וזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה, השימוש במיני 2DE מאפשר לאשר 1 בדיוק) את זהותו של החלבון מבודד ו2) טבעו של ההבדל: השינוי ברמת isovariant / איזופורם של ביטוי, שלאחר translational שינויים ותהליכי מחשוף למשל. עם זאת, יש צורך לפתח את מאגר תמוגה מתחיל שניהם בקנה אחד עם 2D-DIGE ועם מיני 2DE על מנת להגביל תפוצות הפוטנציאליות הנובעות מהשימוש בפרוטוקולי חילוץ כי הם מאוד שונים.

במאמר הנוכחי, אנחנו דהשתואר בפרוטוקול מותאם להכנה, החילוץ וביצועים של 2D-DIGE וטכניקות מיני 2DE לחלבונים במוח מגיעים מהרקמה אנושית ועכבר.

Protocol

1. Homogenization והפקת חלבון סה"כ מרקמת המוח אנושית ומאוסה המגון רקמת מוח. Homogenize רקמת המוח 10% (w / v) ב8 M אוריאה, 2 M thiourea ו1% w / v חיץ SDS (UTS) באמצעות זכוכית הקדר (עבור דגימות אנושיות) או homogenizer טפלון (עבור דגימות עכברים). Sonicate ב60 הרץ 30…

Representative Results

פרוטאומיקה על רקמת המוח נותרת מאתגרת שכן אין חיץ אידיאלי קיים כדי להתאושש מחלבונים 100%, במיוחד קרום הקשורים או חלבוני שלד תא. הסט הראשון של ניסויים שהתמקדו בחיפוש אחר מאגר תמוגה מתאים תואם את שתי גישות ואשר מאפשרת לשחזר את פנל גדול של חלבון. לפיכך, שלושה מאגרי תמוגה הי?…

Discussion

גילוי פתולוגיות שינויי ביטוי של חלבונים, חיפוש אחר סמנים ביולוגיים והאפנון של מסלולים אפשריים למטרות תרופתיים הם בין המטרות של neuroproteomics גישות ^30. בין הכלים מתעוררים, שדה 2DE מוסיף expectative מבטיח. ובכל זאת, יש להגיע להסכמה על מנת למזער ולהגדיל את שונות שחזור בניסויים….

Materials

CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval/size
IPG Buffer, pH X-X	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval desired
AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1	GE Healtcare	551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l	GE Healtcare	17-1335-01
KIT BOX IPG 1 * 1 KIT	GE Healtcare	28-9334-92	Plastic box to make the passive rehydration
MILLEX GS Filter	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)	Bio-Rad		Reference in function of the MW to separate
IPGphor III Isoelectric Focusing Unit	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix Large Electrophoresis System	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm	Gel Company	P2D1.5