一种手术方法被描述,暴露腹头骨在新生大鼠。使用这种方法,可以打开一个开颅麻醉幼仔的脑干进行急性电生理和双光子显微镜实验。
采用了开颅手术,在体内实验提供了一个机会,探讨不同的细胞过程的动态在哺乳动物的大脑在成年和发展过程中。虽然大多数体内方法使用一个开颅研究位于背侧的大脑区域,脑干区域如脑桥,位于腹侧保持相对充分研究。该协议的主要目标是促进进入脑干腹侧结构,使他们能够利用电生理和影像学方法加以研究的体内 。这种方法允许研究的远距离轴突结构的变化,电活动的单一模式和细胞的合奏,以及新生动物的变化,血脑屏障的通透性。虽然这个协议被用于大部分研究在新生大鼠听觉脑干,它可以很容易地适应于其他啮齿动物的研究,如新生儿小鼠,成年罗登TS等脑干区域。
在荧光成像和电生理技术组合使用开颅允许监测血流量,血脑屏障通透性和测量神经元和神经胶质细胞在活的动物1-3的活性。几个实验室都用这个方法来洞察在健康和疾病状态脑生理学,但差距仍然在我们的这些进程的发展过程中是如何产生的理解。此外,大多数研究都集中在那些容易从头骨的背表面接触,这样,脑干腹侧结构与不同的生理作用进行了研究,大多采用体外方法的大脑区域。
该协议的主要目标是提供对啮齿动物的头骨腹开开颅手术的方法。这种方法是改编自大型哺乳动物如狗和猫的感官神经生理学RECO进行的经典研究听觉脑干4-7 rdings。在此协议然而,有一个在新生儿动物进行该过程的新颖的挑战。使用血管的地标,这个改编协议之前已用于研究新生大鼠,成年小鼠和其他脑干区域,如劣质橄榄8-11( 图1)的听觉脑干。
腹开颅比现有的方法来研究脑干腹侧核的主要优点是它提供了直接访问的活体动物兴趣的结构。例如,上橄榄复杂的听觉细胞被本地化为几十微米的距离脑表面,这对探针的目标的位置和使用双光子成像方法,其中成像深度可以通过以下方式限定到0.5mm重要组织光散射和吸收。腹开颅还提供了制备具有相对完整的神经连接,WH非物质文化遗产被破坏的急性和器官切片制剂12。而相比之下,其他的协议, 在体内神经生理学实验13,腹侧的方法可以用多电极记录和提供有关蜂窝合奏信息成像方法相结合( 图6和图7)。最后,在与该协议结合荧光标记的溶质可在血管注射来衡量溶质( 图8)的变化血脑屏障通透性。
时间是至关重要的。一个有经验的研究人员应该能够完成这个协议在1小时内(步骤1-3)。说明对于不同的步骤,时间假设中等专业技术水平高。适当和及时的气管切开及插管是至关重要的,因为透气性差控制,可导致窒息的动物和死亡。肌肉和脂肪组织中的间隙细心也是很重要的,因为错误会导致无法控制的出血动物和死亡。同样地,准备颈动脉插管插入时,需要收紧并切断动脉小心,如果线程结松脱无法控制的出血会发生。最后,开颅手术应慎重,不破坏血管的地标。粗心罢免外聘脑膜层(硬膜),可导致严重的出血和动脉供应的伤害。
通风设置,根据动物的年龄选择。大多数商业供应商提供关于此类设置的有用信息。在年龄大于P15大鼠实验将需要使用大量的动物呼吸机。成年动物可能不需要通风如果用氯胺酮/赛拉嗪,但插管建议,以避免流体进入气管。
此协议中的一个主要限制是,实验只能剧烈进行。在我们的实验室,我们两个长达十几个小时之间进行的实验持久。第二个限制是实验有麻醉下进行。因此,麻醉的选择是在实验的规划和设计需要考虑的重要变量。一个相关的问题是,新生儿的动物可以是特别敏感的过量。例如,如果选择氯胺酮/甲苯噻嗪组合,计算的基础上的小狗的体重剂量和给药的药物在最大音量的⅓。由脚趾捏r检查下动物的状态每隔5-10分钟响应声学。如果使用异氟醚,也需要预防措施,以维持一个安全的环境,让调查员(适当通风,并正确校准蒸发器)。
在体视显微镜可被安装在柔性支架来调整视角和促进空间间隙放置的电极和安置动物的双光子显微镜。使用电池为呼吸机的供电可以方便移动的动物和在电生理学实验减少电气文物。为此,小面包板(7.5×12英寸),可用于装配在一起的换气装置中,加热垫和被麻醉的动物( 图2a)。一个有用的和重要的修改,这种设置是增加了装置的手术过程中监测生命体征。一血氧计或其它模拟设备可根据实验室预算使用。
该协议已被用于与电生理和影像学会见部门首长,包括膜片钳记录8,10,11,polytrode记录( 图7),和双光子成像9( 图6和图8)。一个可能的未来的应用将结合这些方法的电生理记录16靶向荧光标记的细胞。
新的成像应用中也可包括2-D或使用双光子显微镜的3-D时间序列。例如,使用钙指标丸剂负荷研究脑干神经元和神经胶质细胞群的活性。 如图8所示 ,染料溶液通过颈动脉注入血液循环,可以用来产生大脑脉管系统的高对比度图像。作为荧光染料填充微血管管腔并扩散到周围组织中,它可以不仅用于计算血脑屏障的表观渗透性溶质而且溶质扩散系数ficient在脑组织3。一个主要的原因为通过颈动脉注入荧光标记的溶质是,该染料溶液可以直接到在大脑微血管无需首先对心脏在尾静脉注射。这带来了至少两个优点。之一是,在微血管管腔的荧光染料的浓度可以是基本恒定的,如果灌注速率是固定在插管位置。这可确保准确测定血脑屏障通透性。另一个原因是,如果测试试剂被包括在灌注液,它会直接进入血 – 脑屏障而不会稀释或与自体循环的其他因素。
新的实验也可以采取转基因动物的基因编码的荧光记者的优势。这将提供以下优点:荧光探针不会需要在原位被加载(除非该实验的设计另有规定),从而节省时间和可能允许更多的完整制剂( 如颅窗口17)。
最后,实验可以在其他脑干区域如下橄榄或面部运动核来完成。知识神经解剖学在一个给定的物种特异性细胞群的发展将是重要的实现这一目标,特别是解剖标志可能会改变动物的生长( 图1)。我们希望该协议鼓励别人学习脑干腹侧结构采用活体电生理和影像学检查方法。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由授出G12-RR003060从NIH / NCRR / RCMI支持,从儿童健康与人类发展,国家科学基金会CBET 0754158和PSC-CUNY 62337-00 40来自新城市大学尤妮斯Shriver国家学院授予SC1HD068129约克。
Absorbant pads | Kettenbach | Sugi 31603 | Other options may be available from different companies |
Cautery | Braintree Scientific, INC | GEM 5917 | Other options may be available from different companies |
Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran | Sigma | T1287-500MG | Other options may be available from different companies |
Dissecting Chisel | Fine Science Tools | 10095-12 | Other options may be available from different companies |
DiI | Invitrogen | V-22885 | Other options may be available from different companies |
Elastomer | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Other options may be available from different companies |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Other options may be available from different companies |
Forceps | Fine Science Tools | 11027-12,11617-12, 11616-16 | Other options may be available from different companies |
Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | Other options may be available from different companies |
Heating pad | FHC | 40-90-2 | Other options may be available from different companies |
Intubation tubing | Braintree Scientific, INC | BIO CO-KIT | Choose age appropriate size |
Light source | Spach Optics | Schott Ace illuminator | Other options may be available from different companies |
Micro drill | Braintree Scientific, INC | MD-1200 120V | Other options may be available from different companies |
Paper tape | Walgreens | Generic brand | Other options may be available from different companies |
Syringe filter | VWR | 28145-483 | Other options may be available from different companies |
Syringe pump | VWR | 52459-008 | Other options may be available from different companies |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | Other options may be available from different companies |
Suture | Ethicon | Prolene 86979 | 6-0 size |
Tubing | Braintree Scientific, INC | Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120 | Other options depending on pup’s age |
Vaporizer (isoflurane) | Vetequip Incorporated | 911103 | Other options may be available from different companies |
Ventilator (minivent) | Harvard Apparatus | 730043 | Use for P0-P12 rats |